[发明专利]一种兴安藜芦农杆菌转化方法

权利要求书

1.一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

(1)愈伤组织诱导

收集兴安藜芦种子，消毒后在解刨显微镜下抠出未成熟胚，放在MS培养基上，暗培养，3-4周继代一次，3-4个月后胚性愈伤组织转移到愈伤AA培养基中，3-4周继代一次，得到胚性愈伤组织；

(2)转化与植株再生

用胚性愈伤组织作为侵染的外植体，农杆菌菌株用LBA4404，农杆菌Ti双元载体为pCAMBIA3300，pCAMBIA3300包含一个BAR基因，抗性是除草剂抗性，将上述农杆菌菌株培养至菌液的OD值为0.4-0.6时，将胚性愈伤组织放入农杆菌菌液中，恒温摇床培养后，把胚性愈伤组织转移到含有40-60μM的乙酰丁香酮，25-35g/L蔗糖，2-4g/L植物凝胶的共培养的培养基上共培养，暗培养后，将愈伤组织用无菌水水洗，用滤纸滤干，放入加有3-5mg/l的2,4-D,25-35g/L蔗糖,2-4g/L植物凝胶,240-260mg/L替卡钠,90-110mg/L头孢，15-17mg/L磷百菌素的转化AA培养基中，暗培养，4周继代一次；重复上述步骤3-4轮后，将植物组织放入含有草丁膦的选择培养基中，24-26℃光照培养，4-5周后，将得到的幼苗移到锥形瓶中生根培养，1个月后将长势好的苗移栽到温室。

2.根据权利要求1所述的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，上述兴安藜芦种子消毒处理的方法为：用70％的乙醇水溶液进行表面消毒后，再用加入几滴吐温20的质量分数为1.6％的次氯酸钠水溶液消毒15分钟,灭菌水洗3遍后，消毒完成。

3.根据权利要求1所述的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，上述步骤(1)中MS培养基包括146mg/l的谷氨酰胺，200mg/l酪蛋白水解物，质量分数为3％的植物凝胶，8mg/l毒莠定。

4.根据权利要求1所述的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，上述步骤(1)中愈伤AA培养基包括4mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸，质量分数为0.3％的植物凝胶。

5.根据权利要求1所述的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，上述步骤(2)中农杆菌菌株培养的方法为：将农杆菌菌株在含100mg/L卡那霉素，50mg/L利福平，50mg/L链霉素的LB固体培养基上28℃培养2-3天，菌液用含有50μM的乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬。

6.根据权利要求1所述的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，上述暗培养的温度均为25℃。

7.根据权利要求1所述的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，上述步骤(2)中，恒温摇床培养的温度为24-26℃，转速为30转，培养时间为30min。

8.根据权利要求1所述的一种兴安藜芦农杆菌转化方法，其特征在于，上述步骤(2)中，选择培养基包括2-4mg/L 6-苄氨基嘌呤,2-4g/L植物凝胶,7-9mg/L草丁膦。