[发明专利]烟草多酚氧化酶NtPPO4及其应用

说明书

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草多酚氧化酶NtPPO4基因及其应用专利申请。该基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示。烟草多酚氧化酶NtPPO4由588个氨基酸残基组成，具有3个典型的保守结构域。该蛋白与植物叶片绿原酸含量相关，降低该基因的表达后，叶片中绿原酸含量显著升高。本发明通过对烟草多酚氧化酶NtPPO4的初步研究，发现其与烟草绿原酸含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草叶片中绿原酸含量明显升高，基于这一特性，可为烟草新品种的培育提供应用基础和参考借鉴。

技术领域

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草多酚氧化酶NtPPO4及其应用专利申请。

背景技术

绿原酸（Chlorogenic acid，CGA），又名咖啡单宁，是植物在有氧呼吸过程中经苯丙氨酸途径生成的一种苯丙素类化合物。绿原酸具有重要的药用价值，统计表明，卫生部《药品标准》收录的具有清热解毒和抗菌消炎的170种中成药中均含有绿原酸且为主要成分。另一方面，绿原酸作为一种新型的抗氧化剂，在食品和果品保鲜、防晒护肤等方面也有重要应用。因此，对绿原酸合成代谢途径的深入研究具有十分重要的技术价值和实用意义。

我国的烟草种植面积和产量均居世界首位，而烟叶也是绿原酸含量较高的植物之一（约为3%-5%或更高）。统计表明，每年在烟草的采收和生产过程中会产生约25%的废次烟沫等下脚料不能使用，也因此，如果能够从烟草废料中充分提取绿原酸，不仅可以变废为宝，而且具有巨大的经济利益。而鉴于烟草组织培养技术的日趋成熟，加上烟草易于遗传转化，因此如能通过转基因技术或其他育种技术培育获得高绿原酸含量的烟草品种，可为利用烟草作为生物反应器来提取绿原酸奠定良好的技术基础。

已有研究表明，绿原酸是多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）的一种底物，而PPO是一类广泛分布于植物体中的一种铜结合酶，参与生物氧化，在植物抵御外界病原菌伤害、对植物嫁接生根伤口愈合以及农产品的质量等方面都有重要作用。在烟草中，烟草PPO介导酶促棕色化反应，通过分子氧催化酚类物质氧化成醌，醌再与其他醌、氨基酸、蛋白质及化合物聚合成色素物质。因此，烟草中PPO酶活过高时，不仅影响烟叶外观质量，还会降低烟叶内致香物质的含量，使烟叶品质下降，工业可用性降低。

总之，随着烟草基因工程深入，结合多酚类物质组分对于烟叶品质的重要影响，对于与烟草中多酚类物质相关编码基因的深入研究和开发，可为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定良好的技术基础。

发明内容

基于烟草中绿原酸含量调控相关基因的研究，本发明目的在于提请一个烟草多酚氧化酶NtPPO4基因及其在烟草绿原酸含量调控方面的应用，从而为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草多酚氧化酶NtPPO4的编码基因NtPPO4，由1767个碱基构成，其中特异性核酸片段为33-319位碱基，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

所述编码基因NtPPO4在叶片绿原酸含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草NtPPO4基因表达量，来调控烟叶中绿原酸含量情况。

所述编码基因NtPPO4的PCR扩增制备方法，具体包括如下步骤：

（1）提取（具体例如以烟草K326叶片为样品）基因组，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtPPO4-F：5’- CAGCAAAACTCTCTTTTC- 3’，