[发明专利]一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。本发明首次利用CRISPR/Cas9技术构建胶霉毒素生物合成基因被敲除的重组埃德菌FS110菌株，建立了一种适用于深海真菌埃德菌FS110的CRISPR/Cas9基因敲除体系，从而促进埃德菌FS110的基因工程改造，为埃德菌FS110胶霉毒素的生物合成机制的阐明以及获得更多具有显著生物学活性的胶霉毒素类衍生物奠定分子生物学基础。

技术领域

本发明属于生物化学和分子生物学技术领域，具体涉及一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。

背景技术

深海真菌埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110是一种来源于深海的子囊菌，其能产生大量新型具有抗肿瘤活性的胶霉毒素。前期已经从深海真菌埃德菌FS110中分离得到了30种左右胶霉毒素类化合物，还包括结构罕见的胶霉毒素类二聚体化合物，其中大部分胶霉毒素类化合物物具有较好的抗肿瘤活性及抗α-葡萄糖苷酶的活性，因此具有开发成为药物先导化合物的前景。在此基础上，对埃德菌FS110进行了基因组测序，预测了胶霉毒素生物合成基因簇，并对关键胶霉毒素生物合成功能基因进行了体外生化功能验证。但是目前由于深海真菌埃德菌基因敲除体系尚未成功建立，因此胶霉毒素的生物合成机制尚未阐明，不利于通过代谢工程改造获得新型具有更好生物学活性的胶霉毒素类化合物及其衍生物。

CRISPR/Cas9是一种由sgRNA介导Cas9核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。RuVC1和HNH两个核酸酶活性区域使其具有内切酶活性，在gRNA引导下能对靶标基因进行切割。CRISPR/Cas9系统由于基因敲除效率高、构建简单，成本较低等优点已经在哺乳动物细胞、干细胞和植物等真核细胞的基因组编辑方面有着十分广泛的应用，而由于相应载体的缺乏，CRISPR/Cas9系统在丝状真菌中较少，尚未见到利用CRISPR/Cas9系统提对深海真菌进行基因敲除的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种适用于深海真菌埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。

本发明的第一个目的是提供适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括以下步骤：

a.以埃德菌FS110基因组DNA为模板，以引物5SrRNA-promoter-F、5SrRNA-promoter-R作为引物进行PCR扩增，得到含有一个BglII酶切位点的5SrRNA启动子的片段1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

b.以人工合成sgRNA序列及其终止子序列为模板，以引物5SrRNA-sgRNA-F、sgRNA-Terminator-R作为引物进行PCR扩增，得到含有一个PacI酶切位点、sgRNA及其终止子的片段2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

c.将步骤a得到的片段1和步骤b得到的片段2混合作为模板，进行融合PCR，得到5SrRNA启动子-靶向序列-sgRNA-sgRNA终止子片段；

d.对pFC332质粒、步骤c得到的5SrRNA启动子-靶向序列-sgRNA-sgRNA终止子片段分别进行PacI和BglII双酶切，酶切后的片段用T4 DNA连接酶进行连接，得到适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA。

本发明还提供根据所述的构建方法构建得到的适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA。

本发明还提供含有所述的适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA的真菌。

本发明还提供所述的适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA在真菌基因敲除中的应用。