[发明专利]脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，试剂盒包括：核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、脑炎脑膜炎核酸检测试剂、阳性对照品、阴性对照品；脑炎脑膜炎核酸检测试剂包括：肺炎链球菌基因的扩增引物和探针；脑膜炎奈瑟菌基因的扩增引物和探针；流感嗜血杆菌基因的扩增引物和探针；内参RNP基因的扩增引物和探针。同时还提供了脑炎脑膜炎核酸分型检测方法。本发明引入了脑炎脑膜炎特异性的多通道引物探针，既可减少工作量，又避免其他检测方法特异性不高、容易漏诊和误诊的问题，还能实现同一体系多重同时检测三种病原体且各通道引物探针相互无干扰，具有敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便等优势，从而快速诊断是否感染三种病原体。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种RT-PCR扩增技术，具体涉及一种脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒及检测方法。

背景技术

脑膜炎和脑炎是一类可由细菌，病毒，酵母菌引起的主要威胁儿童生命的综合征。发病率和死亡率很高，尤其是细菌真菌类脑膜炎。我国五岁以下的儿童中的急性细菌脑膜炎的发病率为(6.95～22.3)/10,000，脑膜炎和脑炎都是由于中枢神经系统的感染所致，有40％的病人感染后，病程进展较快，直接导致死亡，存活者也会留下神经功能方面的缺陷。脑炎和脑膜炎可能同时存在，成为脑炎脑膜炎，或者有相同的症状，例如头痛发热。据报道，肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌，是最为流行的三种病原菌。

肺炎链球菌(pneumococcus)属于革兰染色阳性菌，肺炎球菌主要的致病物质是肺炎球菌溶血素及荚膜。荚膜具有抗原性，是肺炎链球菌分型的依据。此菌可引起大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎等疾病，是世界范围内引起儿童和成人感染脑膜炎的主要病原菌，澳大利亚在2016年共有1636例肺炎球菌的病例，被诊断为脑膜炎的共有126例，在澳大利亚的侵入性疾病中对盘尼西林敏感的占到10～12％，因此在讨论经验性治疗方案时，这是非常值得考虑的。在三个月到五岁的儿童中，肺炎链球菌是导致细菌性脑膜炎的主要病因，据估计在我国每年在一个月到五十个月的儿童中，肺炎球菌脑膜炎的发病率为14/10万。

脑膜炎奈瑟菌，也叫脑膜炎双球菌，是一群革兰染色阴性双球菌。脑膜炎双球菌(meningococcus)的流行程度因地理位置而不同，A血清型主要在亚撒哈拉的脑膜炎地带(到非洲和中东的旅行者推荐注射针对该病原菌的疫苗)，B血清型主要在发达国家，据报道在2015年，澳大利亚的182例脑膜炎球菌感染的患者中，有53例被诊断为脑膜炎球菌脑膜炎。从2005～2010 年，我国的脑膜炎球菌的发病率平均为0.09/每10万人，新疆为发病率最高的地方，安徽省占据大多数案例，1岁以下的儿童发病率最高，在已确认的病例中，ABC三种血清型所占的比例分别为37.2％、11.5％和42.7％。

流血嗜血杆菌简称流感细菌，是寄居于人类上呼吸道的正常菌群，属嗜血杆菌属，本属细菌因人工培养时必须加新鲜血液或血液成分方能生长，故名嗜血杆菌。流感嗜血杆菌是嗜血杆菌属中最常见的对人有致病性的细菌，可引起原发性化脓性感染和呼吸道继发感染。流感嗜血杆菌还是导致儿童脑膜炎，肺炎，会厌炎的主要病原菌，尤其是在五岁以下的儿童中，世界范围内每年致使2000万新增病例，30万死亡病例，作为儿童防疫工作的一部分，在使用了流血嗜血杆菌疫苗的国家，感染情况已经大大减少。在美国由于使用了疫苗，十年间，每年的五岁以下发病人数已由10000例减少至200例。

荧光定量PCR技术是一种传统的生物分子检测方法，具有高敏感、高特异、高准确性且能实现多重实时检测的优势，目前已被广泛用于核酸 (DNA/RNA)分子检测。

目前，在中国专利文献中公开的涉及脑炎脑膜炎核酸检测的试剂主要有：