[发明专利]一种多焦点超分辨光学显微成像方法及装置

说明书

本发明提供了一种多焦点超分辨光学显微成像方法及装置，通过将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光，再通过空间光调制器，将正弦调制的激光调制成多个光束，同步并行扫描激发成像样品，从而成倍提高了扫描效率，有效解决单点扫描时成像时间长的问题，利用非正弦荧光结构光图像的所有频率分量叠加重构待成像样品的超分辨率图像，对比衍射极限其分辨率提高3倍，因此本实施例的方法可以实现快速超分辨率双光子荧光显微成像。本发明所公开的方法及装置可以满足几十纳米甚至更高的双光子荧光成像需求，提高双光子荧光结构光图像分辨率。

技术领域

本发明涉及光学显微成像技术领域，尤其涉及的是一种多焦点超分辨光学显微成像方法及装置。

背景技术

荧光显微技术在生命科学领域中具有十分重要的作用，其中，双光子荧光显微技术是近年发展起来的一种新型非线性光学成像方法，由于其优异的特性已广泛用于细胞生物活细胞、组织的长时间动态三维成像。双光子荧光显微技术同时吸收两个光子，发射出的荧光波长远离激光，可实现暗场成像；其技术采用近红外激光源，可实现生物组织中深度物质层析成像；另外，双光子荧光显微技术可以避免荧光漂白和对生物细胞的光毒性问题。最后，要产生双光子吸收，必须要求激光有足够高的光子密度。通常使用聚焦光束，只有在焦点附近的光强才能达到产生双光子和多光子吸收的功率密度条件，而远离焦点的区域，不具备达到产生双光子和多光子吸收的功率密度条件，则不产生双光子和多光子吸收，所以和单光子荧光相比，多光子荧光具有很高的空间局域特点和空间分辨能力。

由于成像系统传递函数的存在，所有的荧光显微技术的分辨率都受到衍射极限的限制。为了突破衍射极限，近年来发展了各种各样的超分辨显微技术。例如：受激发射损耗(stimulated emission depletion,STED)技术、结构光照明显微镜(structuredilluminationmicroscopy,SIM)技术以及基于单分子定位的超分辨成像技术——光激活定位显微镜(photo-activation localization microscopy,PALM)、随机光学重构显镜(stochasticopticalreconstruction microscopy,STORM)和基于双光子的扫描结构光照明显微技术等。其中，现有的基于双光子的扫描结构光照明显微技术利用电光调制器(EOM)调制飞秒激光，激光经过系统在样品上聚焦成激发聚焦光点；扫描振镜使激光聚焦在样品上进行二维扫描，激发样品产生正弦荧光图案。聚焦的激光点扫描完整个样品，生成完整的样品图像，图像分辨率低，且单点扫描结构光耗时长，成像速度慢，不利于对活体细胞或组织的超分辨率成像。

因此，现有技术有待于进一步的改进。

发明内容

鉴于上述现有技术中的不足之处，本发明提供了一种多焦点超分辨光学显微成像方法及装置，解决现有双光子SIM技术中单点扫描时间长、成像速度慢和分辨率低的缺陷，同时解决现有多焦点显微技术分辨率低的问题。

第一方面，一种多焦点超分辨光学显微成像方法，其中，包括：

将激光按照预设调制函数调制成激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行分区域扫描；

采集待成像样品各个区域产生的荧光信号，得到各个荧光信号分别对应的荧光结构光图像集；其中，所述荧光结构光图像集包括：多个荧光结构光图像组；各个荧光结构光图像组中含有的多个荧光结构光图像，各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

提取各个所述结构光图像中的频率分量，并且对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。

可选的，所述将激光按照预设调制函数调制成激发光的步骤包括：

根据预设调制函数，将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光。

可选的，所述使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描的步骤包括：