[发明专利]一种宽场超分辨显微成像方法及其系统

说明书

本发明公开了一种宽场超分辨显微成像方法及其系统，所述方法包括步骤：将光源发出的激光通过空间光调制器进行相位调制，再经由傅里叶透镜得到强度调制的光；将所述强度调制的光依次经过管镜、激发滤光片、分束镜、物镜后激发样品发射信号光；通过所述物镜收集所述信号光，并由所述分束镜透射到探测器上；根据至少三个取向上不同相位的信号光结构图案进行重构处理得到超分辨图像。空间光调制器将激光调制成强度满足正弦次幂分布的激发光图案，激发出荧光图案，从而产生多级频谱混叠。通过对混叠频谱的解频和复位，获得更高频样本信息。在非饱和激发条件下，实现超分辨率结构光照明显微成像，空间分辨率由条纹结构光的谐波次数决定。

技术领域

本发明涉及光学显微成像技术领域，尤其涉及的是一种宽场超分辨显微成像方法及其系统。

背景技术

荧光显微镜以其无损、非入侵、特异性标记及可以对活体细胞进行实时动态成像的优势，在生命科学研究中得到了广泛应用。但由于光学衍射极限的限制，一般成像最高分辨率仅能达到约200nm。为了突破衍射极限对荧光显微分辨率的限制，一系列新颖的超分辨显微成像方法被提出。

Hell课题组提出了受激辐射耗尽(stimulated emission depletion,STED)技术，分辨率可以大幅提高到远高于衍射极限分辨率的水平(几十纳米甚至更高)。但高功率的STED光对生物样品损伤较大，特别是活细胞，因此，不适合活细胞动态成像。且必须使用特殊STED染料，限制了样品的范围。Rust课题组提出了随机光学重建显微(stochasticoptical reconstruction microscopy,STORM)技术，分辨率可达到横向高于20nm、轴向高于50nm的水平。但重构一幅超分辨图像需要采集平均数千张原始图像，成像速度受限，同时需要具有开关效应的荧光探针，对染料的要求高，限制了其适用范围。

Gustafsson课题组提出了结构光照明显微(structured illuminationmicroscopy,SIM)技术，SIM基本原理是利用莫尔条纹将原本不能通过系统的高频信息平移到可观察的频率范围内来实现超分辨。由于线性SIM利用强度正弦调制的激发光图案照明样本，激发产生强度正弦调制的荧光结构图案，没有产生高次谐波结构光，因此，对比衍射极限，线性SIM的分辨率最多提高2倍。为了提高线性SIM的分辨率，Gustafsson课题组在线性SIM的基础上提出了饱和结构光照明显微(SSIM)技术，通过荧光饱和激发产生了等幅的高次谐波结构光，将分辨率提高到了几十纳米的水平。目前在SIM这项技术中，只有SSIM才能实现比线性SIM更高的分辨率，然而由于SSIM需要较高的光功率激发光对样品进行荧光饱和激发，导致大的光损伤，这种方法并不适用活细胞成像，无法发挥SIM的优势。

因此，现有SIM技术还有待于改进和发展。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种宽场超分辨显微成像方法及其系统，通过构建含有非等幅的高次谐波的结构光图案激发产生相应的信号光结构图案以及相应的重构算法，旨在解决现低功率激发条件下结构光超分辨显微成像的分辨率低的问题。

本发明解决技术问题所采用的技术方案如下：

一种宽场超分辨显微成像方法，其中，包括步骤：

将光源发出的激光进行扩束准直处理、偏振方向调整处理后，通过空间光调制器进行相位调制，再经由傅里叶透镜变换得到强度调制的光；

将所述强度调制的光依次经过管镜、激发滤光片后得到激发光，通过分束镜反射激发光，并由物镜聚焦后激发样品发射信号光；其中，所述空间光调制器放置到所述傅里叶透镜的前焦面上，所述傅里叶透镜的后焦面和所述管镜的前焦面重合；

通过所述物镜收集所述信号光，并由所述分束镜透射到探测器上，所述探测器用于记录所述信号光的强度并得到信号光结构图案；

改变所述空间光调制器的调制函数，获得至少三个取向上不同相位的信号光结构图案；