[发明专利]一种联合检测多种难培养和鉴定的病原体核酸的方法

说明书

本技术属于人病原微生物快速检测领域，涉及微流控芯片快速检测技术和核酸扩增技术，具体涉及一种联合检测多种难培养和鉴定的病原体核酸的方法。目前临床上有一些难以培养和鉴定的致病菌，其培养所需时间较长甚至无法培养，导致病原菌鉴定难度较大，通常只能依靠临床症状和经验来鉴定并指导用药，容易出现病情延误、漏诊、甚至误诊的情况。本发明提供一种联合检测多种难培养和鉴定的病原体核酸的方法，在一张芯片内快速检测多种病原体，从而降低难培养病原体的鉴定难度，加快病原体的鉴定速度，提高检测的准确性。

技术领域

本技术属于人病原微生物快速检测领域，可快速检测难培养和鉴定的病原体，提供了一种联合检测多种难培养和鉴定的病原体核酸的方法。涉及微流控芯片快速检测技术和核酸扩增技术；涉及多病原体的特异性引物组；还涉及到将引物和引物组用于核酸扩增法检测不同病原体的检测方法。

技术背景

人类感染性疾病主要包括血流感染、呼吸道感染、细菌性脑膜炎及脑脓肿等。对于感染性疾病，临床常规的血液等生化指标分析仅能通过免疫细胞及球蛋白水平初步判断病因，无法确定病原菌的种属。临床上感染性疾病非典型性和混合感染的趋势逐渐增加，很难通过病原鉴定以外的方法进行诊治。

目前临床上对病原菌鉴定的方法主要是培养法。其主要步骤取样、培养、鉴定。培养法本身存在较多缺陷，不能满足临床需要。首先培养法检测耗时长，培养时间与所感染的细菌种类有关，至少用时2-3天，真菌所需的培养时间更长，当临床出现急性病症时，培养法无法适用。培养法对实验条件要求较高，需要的培养基种类较多，乡镇医院、社区医疗单位和户外等均无法使用培养的检测方法，很容易对病人造成贻误。另外，临床上出现的一些难以培养的病原菌，更是增加了鉴定的难度，多以临床经验来进行判断，易出现病情延误、漏诊和误诊等现象。

耶氏肺孢子菌是引起艾滋病和免疫功能低下患者肺孢子菌肺炎(pneumocystispneumonia，PCP)的重要机会性致病菌。PCP主要发生于AIDS、恶性肿瘤以及自身免疫病等免疫功能低下者，病死率高。患者症状与体征不典型，且发病迅速，易被误诊，因此早期快速诊断很重要。但缺乏体外培养系统以及镜检准确性低，PCP的诊断仍充满挑战。染色镜检是诊断的金标准，以检测到包裹为依据，但敏感性不高且费时，容易造成漏检、误检。

新型隐球菌是一种土壤真菌，属于条件致病菌，平时可存在于人体体表、口腔和粪便中，当机体免疫力降低时，可引起隐球菌性脑膜炎和(或)脑炎。近年来，隐球菌性脑膜炎和(或)脑炎发病率呈上升趋势，且发病隐匿，病程缓慢，通常进行脑脊液检测，但是例如细胞涂片，以墨汁染色发现新型隐球菌生长为明确诊断方法，但是其灵敏度仅为30％～50％，疾病早期易误诊，需反复多次检测，从而增加诊断难度；病原培养，新型隐球菌培养耗时较长，生长缓慢(少数病例培养2-3周才开始生长)，故敏感性较低，不能满足早期诊断的需要。

星型诺卡菌是对人体致病的机会感染致病菌，可通过带菌的灰尘经呼吸道种植于肺部而引起感染，也可经皮肤创面进入血流引起感染。2014年4月，就诊于当地医院的一名男性患者实验室检查结果提示：痰涂片抗酸杆菌阳性，结合CT检查结果，诊断为“肺结核”。但是患者经近两个多月的抗结核治疗，症状无明显改善，再次送检痰培养，并延长培养时间，痰涂片行改良抗酸染色、抗酸染色、革兰染色检查，最后确诊为肺星型诺卡菌病。

马尔尼菲青霉是一种少见的致病菌，可引起患者局部甚至全身性感染。自20世纪80年代以来，由于AIDS病的发病率不断增高，AIDS患者合并马尔尼菲青霉感染的患者逐渐增多。由于此病少见，诊断时不易考虑到，容易漏诊，患者的预后与能否尽早诊断及尽快地抗真菌治疗密切相关。此外，病理组织学表现有时易误诊为结核，而抗结核治疗不仅无效，反而会加剧真菌感染的扩散。

因此，做到快速准确地鉴定致病菌很有必要。本发明所开发的一种联合检测多种难培养和鉴定的病原体核酸的方法，结合了核酸扩增技术和微流控芯片技术，可在一张芯片内联合检测多种病原体，特异性好，操作简单，检测迅速。

发明内容