[发明专利]适用于芸香科植物体外鉴定RNase核糖核酸酶活性的方法

说明书

本发明涉及适用于芸香科植物体外鉴定RNase核糖核酸酶活性的方法，包括以下步骤：制备芸香科植物SRNase的体外重组蛋白样品；制备电泳所需要的凝胶和反应液；将体外重组蛋白样品与反应液在合适的条件下反应并电泳；电泳后，进行照胶，观察凝胶上的条带，在SDS‑PAGE胶上，若在样品蛋白对应显示列上有不同于背景颜色的白色条带，说明样品具有核糖核酸酶活性；在琼脂糖凝胶上，若阴性对照列上有不同于背景颜色的白色条带，且随着重组蛋白的添加量增加，相应蛋白对应显示列上条带亮度越来越弱，则说明样品具有核糖核酸酶活性。本发明的检验核糖核酸酶活性的方法更加方便快捷，且适用于芸香科植物中核糖核酸酶活性的检测。

技术领域

本发明涉及生物分析技术领域，具体涉及一种适用于芸香科植物体外鉴定RNase核糖核酸酶活性的方法。

背景技术

转录后调控被越来越多的人认为是基因调控的重要阶段，其中RNase降解mRNA的功能在其中起着重要的作用。RNase通过调控mRNA的新成代谢来调控植物体内基因的表达，从而调节植物适应内部和外界环境变化，提高植物抗逆性、调控植物生长发育、衰老等。鉴定和描述RNase是明确每个RNase功能的第一步，不同RNase的大小从9KD到41KD不等，但大部分RNase活性的最适PH在6.5左右。1964年，C.Poort,和W.J.W Van Venrooy等人使用琼脂糖凝胶来检测RNase的活性，将电泳图浸没在含有底物的溶液中，进行数小时的孵育，最后用氨基黑染色，凝胶上的白色点状区域即为RNase反应位置。后来Raunio和Gabriel改进为，在凝胶中使用覆盖了底物的第二张幻灯片，通过观察底物沉积线来找到反应位置。1970年，Kamm.R.C和Smith.A.G,利用染料溴化乙锭能与非水解RNA结合并形成荧光复合物，而不能与水解RNA结合的性质，使用紫外分光光度计来测量RNase的活性。

Poort和Van Venrooy等人第一次在拟南芥中用底物凝胶来分析核糖核酸酶活性，这种后面慢慢被应用到小麦、玉米等其他植物中。在此之前，人们一直用非变性凝胶来检测其活性，后来因为变性电泳后的复性变得更加简单，慢慢统一都使用SDS-PAGE凝胶来检测活性。

本发明人研究发现了芸香科柑橘属也是基于SRNase的配子体自交不亲和系统，为了进一步确定柚子中发现的SRNase的核糖核酸酶活性，研究者开发了两种不同的核糖核酸酶活性的测定方法，花柱SRNase的核糖核酸酶活性占花柱蛋白提取物核糖核酸酶活性中的很大一部分。因此我们可以通过检测重组SRNase蛋白的核糖核酸酶活性来检测RNase的活性。通过观察花柱蛋白能否降解RNA来明确SRNase的核糖核酸酶功能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种适用于芸香科植物体外鉴定RNase核糖核酸酶活性的方法。

为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：

适用于芸香科植物体外鉴定RNase核糖核酸酶活性的方法，包括以下步骤：

步骤S1、制备芸香科植物SRNase1或SRNase2的体外重组蛋白样品；

步骤S2、制备电泳所需要的SDS-PAGE/琼脂糖凝胶和反应液；

步骤S3、将体外重组蛋白样品与反应液在合适的条件下反应并电泳；

步骤S4、电泳后，进行照胶，观察凝胶上的条带，在SDS-PAGE胶上，若在样品蛋白对应显示列上有不同于背景颜色的白色条带，说明样品具有核糖核酸酶活性；在琼脂糖凝胶上，若阴性对照列上有不同于背景颜色的白色条带，且随着重组蛋白的添加量增加，相应蛋白对应显示列上条带亮度越来越弱，则说明样品具有核糖核酸酶活性。

进一步的，所述步骤S2中的SDS-PAGE胶为1mm，10孔的15％的SDS-PAGE胶；所述琼脂糖凝胶为1％浓度并用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶。