[发明专利]创制水稻高直链淀粉型新种质的方法及其应用

说明书

本申请公开了创制水稻高直链淀粉型新种质的方法，其包括修饰水稻中的OsWaxy基因，使其转录活性增强。本申请还公开了通过所述方法创制的水稻用于育种或改良种质资源的用途，能够靶向水稻OsWaxy基因的sgRNA，以及能够靶向水稻OsWaxy基因的CRISPR/Cas9编辑载体。通过本申请所获得的OsWaxy基因编辑纯合的非转基因的水稻将是非常有价值的种质资源，可以利用它们改良水稻品种的直链淀粉含量。本申请也为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术快速改良水稻品种的直链淀粉含量提供一种有效的策略。

技术领域

本申请涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术创制OsWaxy基因突变体来改良水稻直链淀粉含量的方法。

背景技术

随着人民群众生活水平的日益提高，对大米的消费逐渐转向优质化和专业化。目前，行业内公认的影响大米食味品质的最重要因素为直链淀粉含量，它与米饭质地的硬度、凝聚性和粘度等特性密切相关。在优质化方面，在农业部新标准NY/T 593-2013食用稻品质定级指标中，籼稻和粳稻的一级米都要求直链淀粉含量在13％-18％之间，籼稻二级米要求在13％-20％，而三级米则在13％-22％之间，因此，直链淀粉含量是国家评价优质食用稻的重要指标。与之对应的，保证直链淀粉的含量在13％-20％之间也是水稻优质化育种方向的重要目标。而随着大米消费专业化的发展，对大米直链淀粉含量的需求更加多样化，如专门用于做米粉的大米，或者专门供糖尿病患者或者高危人群食用的高抗性淀粉大米，甚至是南北方人民口感的差异，都要求在水稻育种中，能够快速精准调整直链淀粉含量，开发能够调整不同直链淀粉含量的生物技术，供育种家选择。因此，开发精准调整直链淀粉含量的生物技术手段具有重要的商业价值。

OsWaxy基因位于第6染色体的短臂，早在1990年就已被克隆，是决定直链淀粉合成的关键酶(Wang et al.,1990)。过表达或降低OsWaxy基因表达将导致贮藏器官中OsWaxy基因酶活和直链淀粉含量明显上升或下降。通过突变体实验也发现，缺失OsWaxy基因将获得直链淀粉缺失糯稻。OsWaxy基因表达调控的机制目前还不完全清楚。除基因结构发生改变，影响其表达和蛋白功能外，可能受多个水平、多种因子的协同调控。

发明内容

本申请涉及一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术创制OsWaxy基因突变体来改良水稻直链淀粉含量的方法。最终获得了直链淀粉含量明显升高的优质水稻品种。为实现上述目的，本申请采用如下技术方案。

在第一方面，本申请提供了创制水稻高直链淀粉型新种质的方法，其包括修饰水稻中的OsWaxy基因，使其转录活性增强。

在一些实施方案中，所述修饰通过基因编辑进行。

在一些实施方案中，所述OsWaxy基因包含以下序列或由以下序列组成：SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，或者编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列的核苷酸序列。

在一些具体的实施方案中，所述水稻为籼稻或粳稻。

在一些实施方案中，所述基因编辑通过选自以下的序列特异性核酸酶中的一种或多种进行：CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/Cas12a、TALEN、大范围核酸酶和ZFN。优选地，所述基因编辑通过CRISPR/Cas9进行。

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9包含Cas9，其中所述Cas9包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列。

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9包含第一导向RNA(sgRNA)和第二sgRNA，其中所述第一和第二sgRNA均靶向OsWaxy基因的第一内含子。