[发明专利]基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本建库和检测方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本建库和检测方法。本发明提供的基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本建库方法，是将待检测样本依次经去宿主和提取基因组后进行标记，得到的带标记模板再PCR扩增进行建库，其中，PCR扩增的反应体系进行温度和时间优化，且体系中含有4％(v/v)的二甲基亚砜，减少扩增偏好性和宿主样本检出，同时建库序列长、浓度高，客观性强、准确性高，同时还降低测序难度和测序假阴性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本建库和检测方法。

背景技术

传染病，比如泌尿类感染疾病是人类健康的主要威胁之一。感染的及时准确诊断关乎患者预后。目前以形态学和血清学为主的检测诊断方法具有培养时间长、灵敏度低等诸多不足。本世纪以来，随着核酸测序技术的快速发展和更新换代，基于基因序列分析的病原体分析已经在传染病领域被广泛的应用。但是我国目前就多种病原体同时检测的分子诊断方法尚缺乏，一般都是单一已知病原菌的定向检测，在临床实践中以及传染病防控中的覆盖范围有限。例如传统的PCR扩增分子诊断技术就存在着上述许多难以解决的瓶颈问题，难以满足临床诊疗的需求。

近十年来测序技术的快速发展将病原基因组学的研究推向了一个新阶段，病毒、细菌、真菌和寄生虫的全基因组信息日益增多；基因组学及生物信息学的发展，包括宏基因组学及相应的测序技术，极大扩展了针对包括病原体在内的复杂微生物研究手段。基因组学技术在传染病的预防和控制方面的应用的重要性也随着技术的发展而日益提高。

牛津纳米孔技术公司(Oxford Nanopore Technology，ONT)纳米孔单分子测序技术具有三代测序长读长的优势，最长读长可高达900kb。其便携式测序仪产品MinION还以其U盘大小的体积，灵活控制的测序通量，实时数据产生的测序速度，以及测序与数据分析同步并行的算法，突破了时间和空间上的限制，完美地契合了临床检测的需求。而针对于临床感染的宏基因组分析恰好是纳米孔测序胜任并且具有得天独厚优势的应用领域，尤其适用于针对那些难于体外培养的病原体无法分离为纯株进行全基因组测序。

但纳米孔单分子测序技术对样本量要求极高，文库构建显得尤为重要，目前针对微生物的纳米孔测序建库方法主要为扩增法。该方法需要的核酸起始量少，较适合单独菌株的文库构建，然而该方法单样本成本高，测序通量偏低，如果面对的是富含宿主(人类)的临床样本，尤其是包含多种病原菌的临床样本，即需要解决的问题为宏基因组测序的时候，就会表现出GC偏好性以及大量的人类核酸占用数据量的情况。所谓GC偏好性即优先扩增基因组中GC含量较低的病原菌，少扩增甚至不扩增GC含量高的病原菌，造成在宏基因组这种混合病原菌中每种菌扩增的机会不相同，可能导致重要病原菌的漏测或者少测，影响结果输出的准确性。而与此同时如果人类的核酸占比过高，就可能进一步影响真正重要病原菌的检出及数据量。这就导致诸如泌尿类感染样本难以利用该方法有效检测，给下游测序及分析带来了瓶颈。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本的建库方法，以缓解现宏基因组中人类核酸占比过高，以及感染菌扩增机会不等的问题，影响结果输出的准确性。

本发明的第二目的在于提供一种基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本检测方法，提供一种检测准确性更高的检测方法，改善漏测或少测的假阴性问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本的建库方法，将待检测样本依次经去宿主和提取基因组后进行标记，得到的带标记模板再PCR扩增进行建库；

所述PCR扩增的反应体系中含有3-5％(v/v)的二甲基亚砜；

所述PCR扩增的反应程序促进高GC含量模板的解旋和延伸。