[发明专利]一种高效饲料添加剂纳米小肽铜的制备方法

权利要求书

1.一种高效饲料添加剂纳米小肽铜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）载体天然蒙脱石的预处理

取1kg天然蒙脱石于烘箱中，经60 ℃干燥 48 h 后，使用行星球磨机粉碎过200目筛，置于干燥器中保存；

（2）纳米小肽铜的制备

分别取小肽铜与蒙脱石于锥形瓶中，其中小肽铜与蒙脱石质量比在5以上，加入50mL蒸馏水，然后将锥形瓶置于摇床上，以200r／min转速混匀，100min后，将溶液转移至离心管中离心，以800r/min转速离心5min后去上清液，重复上述操作至上清液透明，去除上清液所得沉淀即为纳米小肽铜；

（3）体外细胞培养

取传代后细胞达到80%融合的猪小肠上皮细胞，调整细胞悬液密度约5×10⁴ml／L，96孔培养板每孔加入100 ul细胞悬液，置于37℃，5%CO₂的培养箱中培养至细胞贴壁，贴壁后第二天给药分别吸出96孔板各孔中的培养液，再用PBS溶液冲洗3次，然后分别加入预先配制的无血清液体培养基100μl，培养12、24、36小时后分别检测细胞活性、吸收效率、氧化应激结果。

2.根据权利要求1所述的一种高效饲料添加剂纳米小肽铜的制备方法，其特征在于：所述天然蒙脱石采购自内蒙古宁城天宇化工有限公司，其主要成分为SiO₂ 60.20％，Al₂O₃13.80％，Fe₂O₃ 1.40％，CaO 2.50％，MgO 2.00％。

3.根据权利要求1所述的一种高效饲料添加剂纳米小肽铜的制备方法，其特征在于：所述小肽铜螯合物采购自奥格生物科技有限公司。

4.根据权利要求1所述的一种高效饲料添加剂纳米小肽铜的制备方法，其特征在于：所述细胞活性检测方法采用CCK-8法，细胞活性计算公式如下：

细胞活性（%）=[Ai-A空白]/[A0-A空白]×100

其中Ai指具有细胞、CCK溶液和铜培养液的孔的吸光度；A空白指具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度；A0则表示具有细胞、CCK溶液而没有铜的孔的吸光度。

5.根据权利要求1所述的一种高效饲料添加剂纳米小肽铜的制备方法，其特征在于：所述氧化应激采用如下公式计算：

数值表示＝(处理组荧光强度－空白组荧光强度)/(对照组荧光强度-空白组荧光强度)

其中细胞荧光图片采用Nikon荧光显微镜拍照获得。

6.根据权利要求1所述的一种高效饲料添加剂纳米小肽铜的制备方法，其特征在于：所述体外细胞培养中对照组为无血清液体培养基，实验组分别为含硫酸铜、小肽铜和纳米小肽铜的无血清液体培养基，每个实验组中铜浓度分别为0.5、1、2、4、8 mg/L，所述无血清液体培养基包括1640培养液40ml，胎牛血清10ml，双抗1ml。