[发明专利]一种快速检测紫藤脉花叶病毒的LAMP引物组、试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种快速检测紫藤脉花叶病毒的LAMP引物组、试剂盒和方法，本发明采用环介导等温技术，并根据Genebank中已提交的WVMV基因的CP序列设计引物，获得LAMP引物组，所述的LAMP引物组包括F3、B3、FIP和BIP四种引物，该试剂盒还包括LAMP反应基础液，LAMP反应基础液和LAMP引物组构成了检测体系，该试剂盒能够简单快速地检测到紫藤脉花叶病毒，其具有快速、灵敏、特异性强等优势，克服了传统技术中的一些不足。应用本发明提供的方法检测WVMV全程可在两个小时内完成，LAMP反应在恒温水浴锅中进行，不需要繁琐的实验步骤及昂贵的分子试剂及仪器。

技术领域

本发明涉及一种快速检测紫藤脉花叶病毒的LAMP引物组、试剂盒和方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

紫藤 (Wisteria Sinensis)是一种大型落叶植物，紫藤花叶病是紫藤的一种严重病害。其最早在美国被报道(Brierley和Lorentz， 1957)。Bos(1970)将其命名为紫藤脉花叶病毒(WVMV)。紫藤花叶病毒(Wisteria venein mosaic virus，WVMV)是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的一员，由紫藤花叶病毒引起的紫藤花叶病已成为世界性病害。感染叶片呈黄化、花叶斑点、变窄、扭曲、坏死斑点，降低开花能力，使它们无法出售，对园艺产业造成了严重的经济损失。

WVMV可由桃蚜(Myzus persica)和豆蚜(Aphis craccivora)非持久性传播，也可摩擦接种传播，但不能由种子传播。在田间防控难度极大，所以早期病害的预警对病害的传播和蔓延尤为重要。但现有传统的鉴定方法耗时耗力，对实验环境要求较高。因此，建立一种快速检测紫藤脉花叶病毒的LAMP引物组、试剂盒，可为紫藤脉花叶病的早期预警提供重要的支撑。

目前，对于病害的诊断，主要有ATP荧光检测法，酶联免疫吸附法(ELISA)，生物传感器技术，基因芯片技术以及目前被广泛应用的PCR的检测技术，其中ELISA免疫反应特异性强，对试剂的选择性高，但很难同时分析多种成分，对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应。近年来，环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种等温的核酸扩增技术，该技术特异性强、灵敏度高，最大的特点是简单易行、成本低。反应在恒温条件下1个小时即可完成，结果通过肉眼观察产物浊度或颜色变化即可判断。自2000 年由日本学者 Notomi等首次开发的一种在恒温条件下特异、高效且快速扩增核酸的技术，该技术针对目的序列设计 2 对特异引物，在具有链置换活性的 DNA 聚合酶的作用下实现高效扩增，具有高灵敏度和特异性，且操作简单的特点，目前在植物病害诊断方面得到了广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有问题，提供一种快速检测紫藤脉花叶病毒的LAMP引物组、试剂盒和方法，可用于快速检测紫藤中的紫藤脉花叶病毒，具有快速、灵敏、特异性强等优势。

本发明的目的是这样实现的，一种快速检测紫藤脉花叶病毒的LAMP引物组，其特征在于，包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP四种反应引物，所述四种反应引物依为：

正向外引物F3： 5'- GTCGTCTCCAGATGTGAAT -3 '；

反向外引物B3： 5'- CAGACCATACCTAGGCATAT -3 '；

正向内引物FIP： 5'- GGCATTTTCAACTATGGGTTTAAGTTGTTTGGGTTATGATGGATGG -3 '；

反向内引物BIP： 5'- AAGCCAACTCTGAGACAAATCATATGGTCCTTCAGCATTCC -3 '。