[发明专利]一种来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶高温突变体

说明书

本发明提供一种来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶高温突变体，以来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)碱性蛋白酶基因subC为基础，通过定点突变PCR技术获得了2个碱性蛋白酶突变体subCMtemp1和subCMtemp2，并分别构建了表达上述突变体的重组菌枯草芽孢杆菌，其发酵上清液酶活在45℃条件下处理10min后酶活残留水平分别为57％和67％，比表达野生型碱性蛋白酶subC的枯草芽孢杆菌酶活残留水平(17％)有了显著的提高。

技术领域

本发明属于蛋白工程改造领域，具体涉及一种新型的碱性蛋白酶突变体蛋白。

背景技术

碱性蛋白酶(alkaline protease)指在碱性条件下(pH在9～11范围内)能够水解蛋白质肽键的酶，其主要成分是一种内切蛋白酶，催化部位为丝氨酸，广泛应用于洗涤剂、食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业。目前所采用的碱性蛋白酶多是经细菌原生质体诱变方法造育的来源于枯草芽孢杆菌2709通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，属于一种丝氨酸碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。生产工艺是采用微滤超滤膜分离、喷雾干燥或真空冷冻干燥等先进技术。碱性蛋白酶是目前市场上流行的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤去污能力，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢,具有独特的洗涤效果，是工业用酶中占据比例最大的酶类，约占全世界每年总销售量的60％左右。

定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向编码目的蛋白的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，是改造、优化基因的便捷方案，也是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。近几年酶的定点突变技术应用主要集中于提高酶的催化活性、改善底物特异性、提高热稳定性、对映立体选择等方面。酶的定点突变技术为酶的结构和功能开辟了崭新的途径，在工业、农业、食品业、环境等领域取得巨大成功。

发明内容

本发明为解决现有技术问题提供了一种在较高温度条件下酶活力得到显著提高的碱性蛋白酶突变体。

所述突变体是由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)碱性蛋白酶基因subC的成熟肽出发，运用定点突变技术获得的，并在枯草芽孢杆菌中进行表达。

本发明一方面提供了一种碱性蛋白酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的碱性蛋白酶的第283位氨基酸由Ala变为Ile，突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明一方面提供了一种碱性蛋白酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的碱性蛋白酶的第306位氨基酸由Gly变为Cys，突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明以来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶subC为基础，通过定点突变技术获得了两个碱性蛋白酶突变体subCMtemp1和subCMtemp2，并在枯草芽孢杆菌中对上述突变体进行了发酵，其发酵上清液酶活在45℃条件下处理10min后酶活残留水平分别为57％和67％，比表达野生型碱性蛋白酶subC的枯草芽孢杆菌酶活残留水平(17％)有了显著的提高。

附图说明

图1：碱性蛋白酶表达载体的质粒图谱；

图2：碱性蛋白酶突变体经热处理后的相对酶活柱形图。

具体实施方式