[发明专利]一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测试剂、试剂盒和检测方法

说明书

一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测试剂、试剂盒和检测方法，属于动物病原检测领域。本发明针对猪瘟病毒5’‑UTR基因和非洲猪瘟病毒P72基因，分别设计并筛选出能覆盖所有毒株，又适合双重检测的引物和探针，包括二对特异性引物和二条特异性探针；本发明还记载了包含该引物和探针的试剂盒以及利用该引物和探针的PCR检测方法；本发明通过引物设计和PCR各组分的调整，在敏感性和特异性均不降低的前提下，实现一次分析，同时检测和区分猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能大大节省检测的时间，为疫病防治赢得宝贵时间。

技术领域

本发明属于动物病原检测领域，具体涉及一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测试剂、试剂盒和检测方法。

背景技术

猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)属于黄病毒科，瘟病毒属，是单股正链RNA病毒，是猪瘟的病原，危害家猪和野猪，其他动物不发病。猪瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。猪瘟对猪危害极为严重，会造成养猪业重大损失。非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起的疣猪、豪猪、野猪以及家养猪的一种烈性传染病。该病毒属于非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属，是线状双链DNA病毒。猪感染该病毒后，主要临床症状表现为高热、食欲废绝、皮肤发绀，剖检后会发现淋巴结、肾、胃肠黏膜等出血，毒力强的毒株感染猪后，造成的病死率可高达100％。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟和非洲猪瘟列为法定上报的动物疫病，在我国2008年修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将猪瘟和非洲猪瘟列为一类动物疾病。

目前，非洲猪瘟常用的实验室检测方法主要为病原学检测。在病原学诊断方面，病毒的分离鉴定是诊断动物疫病的金标准，但由于非洲猪瘟的分离培养对实验室的水平要求较高，多数地方不具备这个条件，因而该方法很难普及推广。荧光PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，具有灵敏度高、特异性强、简便快速、对标本的纯度要求低等特点，是目前应用最为广泛的病原学检测技术，2019年1月4日，中国动物疫病预防控制中心公布了第一批非洲猪瘟现场快速检测试剂评价结果，共3类11个品种，其中有8个为荧光PCR产品。

尽管非洲猪瘟具有典型的临床症状和病理变化，但由于临床感染日趋复杂，多种病原混合感染，因而很难依据临床症状和病理变化对非洲猪瘟作出确诊，尤其与对养猪业危害较大的猪瘟更加无法区分。此外，目前在世界范围内尚无可以有效预防非洲猪瘟的疫苗，因而对于非洲猪瘟只能是尽早做出准确地诊断，从而及时采取相应的扑杀、消毒等措施。如果能够建立一种既方便、快捷，又能区分猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的鉴别诊断方法，从而为临床上猪瘟与非洲猪瘟的快速确诊提供科学、准确的依据，进而为相应防控措施的制定提供指导方向，这将具有巨大的市场应用前景。

目前检测单一猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的荧光RT-PCR和荧光PCR方法和专利均有报道，而能够同时检测猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的双重荧光PCR检测试剂及其制备方法与应用，还罕见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供分别用于检测猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的荧光PCR引物和探针。

本发明的第二个目的是提供用于检测和鉴别猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的双重荧光PCR检测试剂盒。

本发明的第三个目的是提供一种鉴别猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的双重荧光PCR检测方法。

与单重荧光PCR相比，本发明通过引物设计和PCR各组分的调整，在敏感性和特异性均不降低的前提下，实现一次分析，同时检测和区分猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能大大节省检测的时间，为疫病防治赢得宝贵时间；

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：