[发明专利]一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法

权利要求书

1.一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；

步骤二、克隆或合成耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因，构建过表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)中；

步骤二的具体操作步骤如下：

将耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因插入到质粒pET28a中，所述耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因对应的uniprot数据库编号是tll1590，限制性内切酶位点为NdeI和XhoI，耐高温蔗糖磷酸合成酶的cDNA或合成基因末尾加上终止密码子TAA，所获得的质粒命名为pET28a_tll1590；每0.1ml大肠杆菌BL21(DE3)转0.1-10μg质粒pET28a_tll1590；

步骤三、诱导表达耐高温蔗糖磷酸合成酶，经亲和层析纯化后获得重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；

步骤四、将重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖在70℃条件下反应1-24h，获得蔗糖-6-磷酸；所述重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的浓度为0.01-10μg/ml，所述果糖-6-磷酸的浓度为0.1-20mM，所述二磷酸尿苷葡糖的浓度为0.1-20mM。

2.根据权利要求1所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，所述耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因是通过基因合成得到。

3.根据权利要求1所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，步骤三的具体操作步骤如下：

（1）挑取若干大肠杆菌菌落，并置于5-10ml LB液体培养基中，置于摇床中培养，摇床温度为37℃，摇床转速为180-220rpm，过夜培养；扩大到1L LB液体培养基中，置于摇床中培养，摇床温度为37℃，摇床转速为180-220rpm，培养至指数生长期；加入0.1-10mM IPTG诱导蛋白质表达，诱导温度37℃，诱导时间为2-24h；第二天4000-6000g离心收集细菌；

（2）弃上清，加入50ml细菌裂解液，充分悬浮细菌，超声裂解细菌5-30min，功率30%，开3秒，关3秒；

（3）12000-16000g离心15-60min去沉淀，收集上清，上清中含有带His标签的重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；

（4）将上清与Ni-NTA结合，结合温度为4℃，结合时间为0.5-2h；

（5）wash buffer洗脱杂蛋白，elution buffer洗脱目的蛋白；

（6）按照每管收集1ml蛋白质洗脱液的量收集，采用考马斯亮蓝染液检测目的蛋白；

（7）按照5-10U凝血酶切1mg蛋白的量切His标签，并进行透析，透析液为10mM、pH7.5的Tris-HCl和150mM的NaCl，操作温度为4℃。

4.根据权利要求3所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述细菌裂解液中含有：50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和20mM的咪唑。

5.根据权利要求3所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述wash buffer中含有：50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和20mM的咪唑。

6.根据权利要求3所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述elution buffer中含有：50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和500mM的咪唑。

7.根据权利要求1所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，步骤四、将重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖在70℃条件下反应1h，获得蔗糖-6-磷酸；所述重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的浓度为2μg/ml，所述果糖-6-磷酸的浓度为10mM，所述二磷酸尿苷葡糖的浓度为10mM。