[发明专利]改良六孔板及基于该六孔板的细胞免疫荧光染色方法

说明书

本发明公开了一种改良六孔板及基于该六孔板的细胞免疫荧光染色方法，属于生物医学设备技术领域，包括培养板体、盖体与六个培养孔，六个所述培养孔的开口均向上，且其阵列分布在所述培养板体上，所述盖体设置在所述培养板体的上端，可拆卸地覆盖在所述培养板体上，所述培养孔的底端表面上开设有开口向上的倒圆台形凹槽。本发明通过在倒圆台形凹槽的侧边缘设置预留槽，在进行免疫荧光实验时，可以方便地通过镊子取放显微盖玻片，节省了实验人员的操作时间，从而使实验人员的工作效率得以提高；能够在提高免疫荧光染色质量的同时，减少抗体孵育所花费的时间，避免显微盖玻片在取放过程中发生碎裂，减少抗体的使用量，节约成本。

技术领域

本发明涉及生物医学设备技术领域，具体涉及一种改良六孔板及基于该六孔板的细胞免疫荧光染色方法。

背景技术

免疫荧光技术是细胞、分子生物学常用的一种实验方法。该技术是通过用已标记荧光素的荧光抗体(抗原)作为探针，来检测组织或细胞内相应的抗原(抗体)。在组织或细胞中所形成的抗原-抗体复合物上沉着有荧光素，在荧光显微镜下观察样品，荧光素受激发光的照射而发出荧光，通过荧光所在的细胞或组织，实现对抗原或抗体的定位，同时还可利用定量技术对样本进行定量。荧光素既能标记抗体，也能标记抗原，但由于抗原结构和理化性质较复杂，荧光素标记的条件不易控制，通常用荧光素标记抗体，因此也称为荧光抗体技术。

按照抗体的使用，免疫荧光分析分为间接免疫荧光分析和直接免疫荧光分析两种。间接免疫荧光分析方法通过抗原特异性第一抗体(一抗)标记抗原，再用荧光分子耦联的第二抗体(二抗)特异性标记一抗，从而使抗原所在位点发出荧光。而直接免疫荧光分析是用荧光分子耦联的抗原特异性的抗体直接标记抗原的方法。无论是间接免疫荧光分析还是直接免疫荧光分析，基于细胞爬片的免疫荧光方法均适用。

目前国内主要基于免疫荧光技术研发了一些检测方法及产品或细胞培养相关工具，相关专利申请如专利申请号为CN201821041666.1的中国实用新型专利中公开的一种便于免疫荧光样品制备的玻底培养板，以及专利申请号为CN201810908228.9的中国发明专利申请中公开的一种检测HER2抗原不同位点的免疫荧光试剂盒及应用。这些方法及装置都太过于复杂，不易操作，荧光背景较深。

传统的细胞免疫荧光染色方法主要包括以下步骤：

1、将细胞种植到铺有显微盖玻片的普通六孔板中。2、待细胞生长至满度达到显微盖玻片面积的70％左右时进行细胞爬片制备。3、吸弃培养基，用PBS溶液清洗显微盖玻片2次，向各培养孔中加入4％多聚甲醛溶液，室温固定细胞30分钟，然后吸弃六孔板中的固定液，用PBS溶液清洗显微盖玻片3次，每次5分钟，洗去多余的多聚甲醛。4、向每个培养孔中加入0.5％穿膜液(500μL Triton X-100溶于100mL PBS中)，室温孵育30分钟；穿膜结束后，吸弃0.5％穿膜液。5、用5％BSA封闭细胞1小时。6、用0.1％PBST溶液(100μL Tween-20溶于100mL PBS中)将兔来源的γ-H2AX一抗按照1：1000的倍数稀释，稀释后的抗体滴加到铺有封口膜的塑料板上，再用镊子把显微盖玻片夹出六孔板，使含有细胞的一面与抗体稀释液接触，倒扣于封口膜上，抗体与细胞室温孵育1.5小时。7、吸弃5％BSA后，用镊子把显微盖玻片夹回六孔板中，之后在摇床上用0.1％PBST溶液清洗显微盖玻片3次，每次5分钟。8、用0.1％PBST溶液将Alexa 488荧光标记的山羊抗兔二抗按照1：1000的倍数稀释，稀释后的抗体滴加到铺有封口膜的塑料板上，再用镊子把显微盖玻片夹出六孔板，使含有细胞的一面与抗体稀释液接触，倒扣于封口膜上，室温避光孵育1小时，然后用镊子把显微盖玻片夹回六孔板中，之后在摇床上用0.1％PBST溶液避光清洗3次，每次5分钟。9、用1μg/mL的Hoechst33342避光染核8分钟，用PBS溶液避光清洗3次，每次5分钟。11、在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂，把经抗体标记的显微盖玻片中有细胞的一面倒扣于抗荧光淬灭封片剂上，-20℃保存。