[发明专利]一种同时检测4种玉米病毒的多重RT-PCR方法

说明书

本发明公开一种同时检测4种玉米病毒的多重RT‑PCR方法，属于植物病毒检测技术领域。本发明所述方法以玉米延长因子1α(Elongation factor 1α，EF 1α)基因作为内参基因，在对多重PCR检测体系的退火温度和引物浓度进行优化的基础上，建立了一种同时检测四种玉米病毒MCMV，SCMV，MaYMV和MATV的多重RT‑PCR检测法。本发明所述多重PCR检测体系简单、快速、经济、耗时少的检测方法,能同时对玉米的四种病毒(MCMV,SCMV,MaYMV,MATV)进行检测；该方法可广泛应用于农业对玉米上的该四种病毒进行提前诊断，对控制病害的发生和增加经济效益有十分重要的意义。

技术领域

本发明涉及一种同时检测4种玉米病毒的多重RT-PCR方法，属于植物病毒检测技术领域。

背景技术

玉米是一种重要的经济作物，并在全世界范围内被广泛种植，主要的种植地有北美、亚洲、非洲和拉丁美洲。中国是世界上第二大玉米消费国和生产国，预计2020年产量将增加至2500万吨。但是，据报道，在玉米生长过程中，有50多种病毒可侵染玉米并造成重大产量损失。这些病毒在玉米中经常形成复合侵染，包括两种或两种以上的病毒的复合侵染。例如，玉米致死性坏死病(MLND)是由玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)和马铃薯Y病毒科病毒中的一种病毒形成复合感染所引起的，其中MCMV与甘蔗花叶病毒(SCMV)形成复合侵染是最常见。

玉米致死性坏死病是一种严重的世界性玉米病害，可造成高达100％的产量损失。最近，在与MCMV和SCMV复合侵染所引起的玉米致死性坏死病玉米植株中发现了其他一些玉米病毒的侵染。1978年，首次报道了MCMV和SCMV在玉米中的同时侵染，并引起了玉米致死性坏死病。2016年，Chen and Jiang et al.(2016)在MCMV和SCMV复合侵染样品中检测到大量的MaYMV。2017年，Alvarez-Quinto et al.(2017)已发现玉米相关的整体病毒(MATV)与SCMV和MCMV形成复合侵染，并于2018年，Redinbaugh et al.(2018)也同样发现MATV与SCMV和MCMV形成复合侵染，并且也发现了MaYMV同时与MATV、SCMV和MCMV共同形成复合侵染(Read et al.,2019)。这些结果表明，这4种玉米病毒(MCMV、SCMV、MaYMV和MATV)均可在自然环境中同时复合侵染玉米。

MCMV是番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)成员，SCMV是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员，这两种玉米病毒是在19世纪首次报道的。MaYMV和MATV是近年新发现的玉米病毒，2016年在中国首次报道，MaYMV是黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的成员，MATV是整体病毒科(Totiviridae)整体病毒属(Totivirus)的成员。这4种病毒均属于RNA病毒，其中MCMV，SCMV和MaYMV属于单链正义RNA病毒，MATV属于双链RNA病毒。目前检测MCMV病毒的方法有ELISA，RT-PCR，Real-time TaqMan RT-PCR，RT-LAMP和RPA(Jiao et al.,2019)。用于检测SCMV的方法有ELISA,RT-PCR,Real-time RT-PCR and RT-LAMP(Keizerweerd etal.,2014)。检测MaYMV的方法有RT-PCR and Northern blot analysis(Chen and Jianget al,.2016)以及检测MATV的方法有RT-PCR。但是以上所有的检测方法都只能在一个体系中检测一种病毒。而多重PCR检测方法则可用于在同一体系中同时检测多种病毒