[发明专利]一种基于RsaI单酶切gluA基因区分克罗诺杆菌属不同种的分子分型方法

说明书

本发明涉及一种基于RsaI单酶切gluA基因区分克罗诺杆菌属不同种的分型方法，属于食品微生物检验技术领域。本发明的操作步骤分为两个阶段，1.第一阶段，通过克罗诺杆菌特异性引物扩增得到克罗诺菌属六种不同菌的gluA基因片段，2.第二阶段，采用RsaI酶切第一阶段扩增的克罗诺杆菌特异性gluA基因片段，获得克罗诺菌属六种不同菌的差异性PCR‑RFLP指纹图谱，进而区分克罗诺菌属不同菌种。通过大量克罗诺杆菌属的菌株事例验证，该分子分型方法能有效获得不同种差异性的酶切多态性图谱，快速、准确区分克罗诺菌杆属六个不同菌种。本发明适用于区分克罗诺杆菌属的菌种，对食品中克罗诺杆菌污染的精准溯源具有重要实际意义。

技术领域

本发明属于食品微生物检验技术领域，具体涉及基于RsaI单酶切gluA基因区分克罗诺杆菌属不同种的分子分型方法。

背景技术

克罗诺杆菌属（Cronobacter），是能引起严重感染的食源性致病菌。食品污染数据调查表明婴幼儿配方奶粉是其感染的主要传播媒介。目前，克罗诺杆菌属的分型技术主要包括抗生素分型、噬菌体分型、Enterobabcterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR（ERIC-PCR）, 脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE）、随机扩增多态性（Random Applied Polymorphic DNA-PCR）等技术，这些方法无法有效区分克罗诺菌属不同的菌种，而多位点序列分析 (Multil℃us Sequenching Typing, MLST) 能对克罗诺菌属的不同种进行区分，但操作繁琐且技术操作要求高（核酸纯化、测序与序列比较分析），耗时较长（普通实验室需至少2天以上），不利于食品加工过程中该菌污染源头的快速鉴定。因而，操作方便、快速地区分克罗诺菌属不同种的分子分型方法对食品中克罗诺杆菌污染的精准溯源显得极为迫切。

发明内容

为了方便、准确、快速鉴定克罗诺杆菌属的不同菌种，达到对食品中克罗诺杆菌污染源头的快速鉴定，本发明提供一种基于RsaI单酶切gluA基因区分克罗诺杆菌属不同种的分子分型方法。

一种基于RsaI单酶切gluA基因区分克罗诺杆菌属不同种的分子分型方法操作步骤如下：

（1）扩增基因片段

选用克罗诺杆菌特异性gluA基因，所述gluA基因为克罗诺杆菌α-葡萄糖苷酶基因；

用一对扩增引物F:5’- AGGGATCCTGAAAGCAATCGACAAGAA -3’；

R：5’- CCGAAGCTTACTCATTACCCCTCCTGATG -3’；

对克罗诺杆菌特异性gluA基因扩增，得到克罗诺菌属六种不同菌的gluA基因片段，

（2）酶切扩增产物