[发明专利]利用NASBA检测REV的方法及使用的成套试剂

说明书

本发明公开了利用NASBA检测REV的方法及使用的成套试剂。成套试剂由“引物F和引物R组成的引物对”和探针组组成；引物对的靶序列含有SEQ ID NO：9所示的特异DNA片段；探针组由SEQ ID NO：3所示的上游探针和SEQ ID NO：4所示的下游探针组成。采用本发明提供的成套试剂检测REV，特异性好(从ALV、MDV、CIAV和REV中准确鉴定出REV)且灵敏度高(灵敏度为2×10个拷贝数/反应体系)，适应于病毒含量低的样品中REV的检测，而且检测方法简便、快速(1h内完成检测)、准确。本发明具有重大的推广价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用NASBA检测REV的方法及使用的成套试剂。

背景技术

禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)可以感染火鸡、鸡、鸭、鹅、鹌鹑等多种家禽和一些野鸟，引起禽网状内皮组织增殖病。禽网状内皮组织增殖病存在不同类型症状和病变，一般包括矮小病综合征、淋巴组织和其它组织的慢性肿瘤、急性网状细胞增生性肿瘤等，还严重影响鸡的生长发育和免疫反应(即造成亚临床感染状态下的免疫抑制)，甚至可与鸡贫血病病毒、马立克氏病病毒等互相作用，给养殖业带来了巨大的损失，已成为当前严重危害我国养殖业的传染病之一。弱毒疫苗中REV的污染是困扰我国养鸡业的一个重要问题。特别是在1周龄内使用的弱毒疫苗，如果污染REV，造成的免疫抑制最为严重。因此，能够及时检测REV是有效预防禽网状内皮组织增殖病的基础。

目前，常用的检测REV的方法包括病理组织检查、ELISA、试纸条、常规PCR技术、杂交芯片法等等。病理组织检查方法耗时长，对动物本身有破坏性，而且对于操作着有较高的经验要求。ELISA以及试纸条检测方法，灵敏度较低，容易造成检测结果假阴性。常规PCR技术仪器价格昂贵、操作繁琐且耗时较长，在基层的推广使用受到极大的限制。杂交芯片法成本较高、操作比较复杂且依赖较多昂贵的仪器。因此，迫切需要建立一种操作方便、特异性好且灵敏度高的检测REV的方法。

NASBA(Nuclear acid sequence-based amplification，核酸依赖性扩增检测技术)是一种扩增RNA的新型技术，其以RNA为模板进行等温核酸扩增并能实时观测检测结果。该技术不需要模板的热变性、长时间循环扩增等过程，而是由一对带有T7启动子序列的引物介导，在体外特异性并连续均一的对单链RNA进行恒温扩增。扩增效率方面，PCR扩增需要约20个循环可将DNA模板扩增10⁹倍，而NASBA只需4-5个循环就可将RNA扩增10⁹倍。灵敏度方面，NASBA可以检测到溶液中低于10copies/μL的痕量靶标，而PCR的检测限在100copies/μL左右。特异性方面，由于NASBA在反应中无需加热变性步骤，不受样品中DNA、肝素、EDTA、柠檬酸盐、血红蛋白、白蛋白和脂质等污染的影响，更适合粗提样品的直接扩增。由于NASBA对模板RNA的高效扩增，大大缩短了反应时间，从而降低了酶促反应过程中核苷酸的错配几率。由此可见，NASBA的扩增效率、灵敏度和特异性均都高于RT-PCR技术。此外，NASBA的仪器成本非常低廉，反应条件为41℃，水浴锅即可满足，不需要复杂的升降温PCR设备。NASBA还具有操作简单、无需产物开盖环节，避免交叉污染等优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异且灵敏的检测REV的方法。

本发明首先保护检测REV的成套试剂，可包括引物对和探针组；

引物对可由引物F和引物R组成；引物对的靶序列可含有特异DNA片段；特异DNA片段的核苷酸序列可如SEQ ID NO：9所示；

探针组可包括上游探针和下游探针；

上游探针可为8-15个核苷酸组成的单链核酸分子，与特异DNA片段中的部分区段相同或互补；

下游探针可为8-15个核苷酸组成的单链核酸分子，与特异DNA片段中的部分区段相同或互补；