[发明专利]一种宽窗口单碱基编辑基因及其应用和育种方法

说明书

本发明提供了一种单碱基编辑系统OsSpCas9‑eCDA及其应用和育种方法。本发明通过大量的实验，尝试采用不同的方式对SpCas9‑ABE进行改造，终于成功获得了一个高单碱基编辑效率、宽窗口的CP1249‑OsSpCas9‑eABE编辑器。并且本发明还提供了包含该CP1249‑OsSpCas9‑eABE基因的表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在水稻基因编辑方面的应用。本发明利用设计的CP1249‑OsSpCas9‑eABE基因构建植物表达载体，进而构建水稻打靶载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的单碱基替换，特别是实现由A/T碱基突变成C/G。利用该编辑器进行水稻基因编辑，可以编辑更多的突变体，获得更多的随机突变或者得到突变更多的突变体库。

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种高效的单碱基编辑窗口拓宽系统CP1249-OsSpCas9-eABE在水稻基因打靶方面的应用。

背景技术

目前的基因编辑技术（ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9）依赖于靶向位点的DNA双链断裂，进而激活DNA修复机制，实现基因矫正的目的。因此，基于双链断裂的基因编辑技术不仅容易产生DNA片段插入和缺失，且可能会产生脱靶效应，最终影响靶基因的功能。而单碱基编辑技术的出现有效地克服了这一问题。

单碱基基因编辑技术（base editors，BEs），指能在基因组特定位点引起单个碱基替换的基因编辑技术。基本原理是将胞嘧啶脱氨酶（APOBEC）或腺苷脱氨酶与现存Cas9n(D10A)融合而形成，依赖于CRISPR原理使得靶点远离PAM端的4-8位的单个碱基发生改变的基因编辑技术。目前的单碱基基因编辑包括两种，一种是CBEs (Cytidine base editors)，即嘧啶碱基转换技术（C/G到T/A），另一种是ABEs(Adenine base editors)，即嘌呤碱基转换技术（A/T到G/C）。

基于CRISPR/Cas9 基因编辑系统，2016年4月和2017年11月，哈佛大学生物化学家David Liu组先后在《自然》和《科学》杂志上报告了两种基因编辑工具——嘧啶碱基转化技术和嘌呤碱基转化技术。之后科研工作者利用不同来源的胞嘧啶脱氨酶和腺苷脱氨酶实现了各物种的碱基编辑。

在植物中，共有三种由C/G到T/A的编辑器已被测试，一种是使用小鼠的胞嘧啶脱氨酶（APOBEC）的BE3系统、一种是使用海七鳃鳗胞嘧啶脱氨酶（targeted activation-induced cytidine deaminase (PmCDA)的定向激活诱导的AID系统，一种是使用了人AID系统变体的rBE5系统。这三种系统与SpCas9或SaCas9系统融合，已在水稻、玉米、小麦、拟南芥、番茄和西瓜中成功实现了单碱基编辑。但目前使用的单碱基编辑系统仍然存在一定的缺陷，如植物的单碱基编辑效率不高，编辑窗口受限等。

但是，高编辑效率和宽窗口的编辑器非常难以获得，往往是可遇而不可求的，目前高编辑效率和宽窗口的编辑器的报道并不多见。

发明内容

针对上述问题，本发明希望提供一种高编辑效率的、窗口拓宽的，由A/T到G/C 的单碱基编辑系统，命名为CP1249-OsSpCas9-eABE。

为了获得这样的CP1249-OsSpCas9-eABE编辑器，本申请的发明人反复进行了大量的实验，通过尝试采用不同的方式对SpCas9-ABE以及其上下游的基因序列交叉替换、顺序调整等，在经历大量失败试验之后，终于意外获得了一种高单碱基编辑效率、宽窗口的CP1249-OsSpCas9-eABE编辑器，其序列见序列表SEQ ID No.1。本发明为 CRISPR/Cas9基因编辑系统又提供了一个优秀的基因资源，具有重大的研究意义和社会价值。并且，本发明将CP1249-OsSpCas9-eABE基因整合到表达载体中，在此基础上构建相应的打靶载体，而后通过水稻遗传转化实现对水稻特异基因编辑。