[发明专利]一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针、试剂盒以及检测方法

说明书

本发明公开了一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针、试剂盒以及检测方法，引物组和探针包括引物组和探针Probe；所述引物组包括正向引物RPA‑F和反向引物RPA‑R；引物组和探针Probe的总扩增产物大小为267bp；所述试剂盒，包括所述的引物组和探针；所述检测方法包括步骤：合成引物组和探针；RPA‑LFD检测方法的建立。本发明不需要复杂精细的仪器设备，减少了资金的投入；实施过程简单易操作，不需要专门的检测人员就可以现场进行检测；检测快速准确，能够实现非洲猪瘟的现场可视化检测，对非洲猪瘟病毒的防控具有重要的意义。

技术领域

本发明属于非洲猪瘟病毒检测技术领域，具体涉及一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针、试剂盒以及检测方法。

背景技术

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA，还省去了额外的cDNA合成步骤。不仅可以对扩增产物进行终点检测，还可以对扩增过程进行实时监控，甚至可以通过试纸条(侧流层析试纸条LFD)读取结果。因此RPA具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、结果读取多元化、操作简便等优点。目前在病原微生物的检测中PRA已经得到了广泛的应用，但在非洲猪瘟病毒的检测中应用较少。

RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。因此，RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，检测条件还需要进一步优化。

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性传染性疾病，可引起家猪的急性出血热，对家猪和各种野猪的致死率可高达100％，非洲猪瘟病毒的主要宿主是非洲野猪和疣猪，以吸食野猪血液为生的蜱虫作为传播媒介。由于非洲猪瘟对猪及其肉类的生产和贸易的国际经济和流行病学的影响，世界动物卫生组织将其列为法定报告动物疫病(OIE,2012)，中国将其列为一类动物疾病，非洲猪瘟严重威胁了全球生猪产业，造成了巨大的经济损失。中国作为世界上最大的生猪生产国和猪肉消费国，非洲猪瘟的爆发，在一定程度上冲击着我国的生猪全产业链。目前我国对非洲猪瘟的严格防控，使得非洲猪瘟疫情得到了有效的控制，非洲猪瘟疫情大幅度下降，但是一套高效的检测方法对非洲猪瘟的防控工作具有重要的意义。

非洲猪瘟病毒引起的发热、食欲不振、精神抑郁、皮肤发绀、呼吸困难、呕吐、腹泻、流产等临床症状与经典猪瘟、蓝耳病、猪丹毒、伪狂犬、猪圆环病毒等的临床症状相似，单单只凭临床症状很难对其进行确诊，必须借助实验室检测方法进行，导致非洲猪瘟现场鉴别诊断困难。有关非洲猪瘟病毒检测方法很多，主流的检测方法为PCR、qPCR方法，这两种方法具有很好的特异性，并且qPCR方法也具有很高的灵敏性，但是两者对仪器设备的要求比较严格，需要精密的变温装置和专业技术，因此这两种方法只能在实验室条件下检测，并且需要较长的时间，限制了其在现场检测中的应用。

发明内容