[发明专利]影响HTNV Gn胞质尾区的出胞表位序列的筛选及鉴定方法

说明书

本发明公开了影响HTNV Gn胞质尾区的出胞表位序列的筛选及鉴定方法，步骤1、获得四种含有突变糖蛋白基因的质粒；步骤2、转染四种含有突变糖蛋白基因的质粒获得其细胞样品和上清样品；步骤3、由细胞样品和上清样品获得二次孵育细胞样品和二次孵育上清样品；步骤4、使用红外成像仪扫描所有的二次孵育细胞样品和二次孵育上清样品，根据是否能检测到Gn蛋白判断二次孵育细胞样品和二次孵育上清样品对应的氨基酸序列是都为影响HTNV GP胞质尾区的出胞表位序列。本发明一种利用ITS2序列鉴定鼠曲草属植物品种的方法，为HTNV生活周期的研究及病毒与宿主相互作用机制奠定了一定的基础，有助于开发限制病毒感染，控制病毒传播的新型药物或疫苗，为研制新型抗HTNV药物和疫苗提供宝贵的经验。

技术领域

本发明属于生物鉴定方法技术领域，具体涉及影响HTNV Gn胞质尾区的出胞表位序列的筛选及鉴定方法。

背景技术

汉滩病毒(Hantaan virus，HTNV)隶属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、汉坦病毒属(Hantavirus)。1976年，韩国学者李镐汪于该国疫区汉滩河流域黑线姬鼠的肺组织中首次成功分离该病毒。目前的研究对HTNV的入胞及胞内复制过程有了一定的认识和研究，但对该病毒如何释放子代病毒，还未有定论。

目前国内外的研究认为，HTNV可能是以两种方式出胞，一是经内质网—高尔基体的分泌途径，HTNV病毒mRNA在内质网上翻译其包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的前体GPC，经剪切后形成Gn蛋白和Gc蛋白两个部分(保留GPC的N端的为Gn，保留C端的为Gc)后经高尔基体分泌释放到胞外；另一是病毒的Gn蛋白和Gc蛋白表达后定位于细胞膜表面，劫持宿主ESCRT直接从细胞质膜出芽。但不论是哪种方式，都需要有宿主ESCRT的辅助。

多数包膜病毒通过其基质蛋白劫持宿主内吞体分选转运相关复合物(Endosomalsorting complex requiredfor transport，ESCRT)使包膜凹陷，出芽并剪切分离使子代病毒分离。而汉滩病毒(Hantaan virus，HTNV)并不具有基质蛋白，但其包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)具有类似的功能。虽然目前有报道突变HTNV GP胞质尾区可影响病毒释放，但相关的关键表位并不清楚，本发明通过对HTNV GP胞质尾区的出胞相关表位进行筛选和鉴定，从而为研究HTNV与宿主细胞作用机制，研发新型抗病毒药物奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供影响HTNV Gn胞质尾区的出胞表位序列的筛选及鉴定方法，筛选出类似基质蛋白作用的GP胞质尾区关键表位序列并鉴定。

本发明所采用的技术方案是，影响HTNV Gn胞质尾区的出胞表位序列的筛选及鉴定方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、从NCBI数据库获得汉滩病毒HTNV的包膜糖蛋白GP的氨基酸序列，并将GP基因序列克隆入pCDNA3.1载体中，在此基础上，利用点突变技术将克隆GP基因序列的Gn蛋白胞质尾区构成口袋结构的四个氨基酸的核酸序列依次突变为丙氨酸，同时将这四个氨基酸替换为经典的类似基质蛋白的晚期结构域L-domain，获得四种含有突变糖蛋白基因的质粒；

其中构成口袋结构的四个氨基酸序列为⁶¹⁵Tyr-Arg-Thr-Leu⁶¹⁸；

步骤2、将293T细胞消化传代得到传代细胞，向传代细胞分别转染四种含有突变糖蛋白基因的质粒，对转染后的传代细胞进行培养，分别获得其细胞样品和上清样品；