[发明专利]一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法及其应用

说明书

本发明涉及一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法及其在Cd毒性效应研究中的应用，它包括无菌水制作、背角无齿蚌暂养、消毒、解剖取鳃、鳃片消化分解、离心收集细胞、人工合成细胞培养基制作、细胞培养步骤、Cd暴露和毒性效应分析。本发明淡水贝类背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法精准，细胞成活率高且存活时间长，突破了目前原代培养淡水贝类鳃细胞的存活率低、存活时间短的“瓶颈”难题，达到实验研究标准，并成功评价了Cd的细胞毒性效应。

技术领域

本发明涉及一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法及其在Cd毒性效应研究中的应用，本发明属于淡水贝类细胞毒理学研究技术领域。

背景技术

我国渔业生态环境重金属污染形势仍较为严峻。《2015年中国渔业生态环境状况公报》即指出我国江河天然重要渔业水域中镉(Cd)超标率为1.5％，国家级内陆水产种质资源保护区Cd超标率达到2.7％。水环境中的Cd易于沿食物链发生生物放大作用，从而导致渔业生物中Cd残留量超标。例如，我国长三角地区池塘养殖水产品中Cd的超标率甚至高达100％(和庆,彭自然,张晨,等.长三角地区池塘养殖水产品重金属含量及其健康风险评价.农业环境科学学报,2017,36(6):1070-1077)。因此，亟需对水环境中的重金属(如Cd)进行污染预警和毒性评价。

淡水贝类背角无齿蚌(Anodonta woodiana)对重金属具有高积累性、低代谢性、体内积累重金属与水环境中重金属含量呈简单相关等特点，被确定为“淡水贝类观察”研究体系的专用指示生物。利用背角无齿蚌已成功监测渔业生态环境重金属的污染状况，并有效评价了Cd等重金属的毒性效应。值得注意的是，生命系统在不同水平对环境污染物胁迫之应答顺序大不相同，个体的应答效应可能要数小时到数年才能把握，而细胞的应答时间可以是数秒到数小时。鳃作为背角无齿蚌对重金属积累的关键“靶器官”，其细胞有潜力作为水环境重金属污染早期预警及毒性灵敏评价的重要研究模型。

需要引起关注的是，由于淡水贝类鳃等组织的生理结构、功能分化、细胞形态等方面的特殊性，至今还没有建立起细胞系，原代细胞培养仍然是主要依托的方法。在细胞毒性效应研究中，对照组细胞的存活率≥90％是开展该研究的基本前提条件。即使是暴露时间较短的急性毒性实验，一般也要求开展连续暴露96h。然而，利用已报道的淡水贝类细胞原代培养方法，维持鳃细胞存活率≥90％的优良状态往往难以超过72h(-DikmenB,Arslan P,Kuzukιranet al.Unio sp.primary cell culture potential inecotoxicology research.Toxin Reviews,2018,37(1):75-81)，这严重限制了基于鳃细胞毒性效应的水环境重金属污染早期预警及毒性灵敏评价的开发和应用。

发明内容

本发明的目的之一是克服现有技术中存在的不足，提供一种存活率高、存活时间长的背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法。

本发明的另一目的是提供一种背角无齿蚌鳃细胞在Cd毒性效应研究中的应用。

按照本发明提供的技术方案，所述一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法包括以下步骤：

a1、将超纯水在110～130℃下灭菌20～30min，灭菌后冷却至常温，制成无菌水；

b1、将洗净的背角无齿蚌置于无菌水中暂养24～96h；

c1、先向4～26℃的900～1000ml的无菌水中加入青霉素50000～500000IU、链霉素0.05～0.5g、庆大霉素0.05～5g和卡那霉素0.03～3g配制成抗生素溶液；再将洗净的背角无齿蚌置于抗生素溶液中消毒1～6h；

d1、解剖出背角无齿蚌的鳃，将鳃置于经0.2～0.3μm滤头过滤的4～26℃的抗生素溶液中，并在抗生素溶液将鳃进一步剪成1～5mm²的鳃片，鳃片在抗生素溶液中消毒1～3h；