[发明专利]一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法

说明书

本发明公开了一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法，特点是包括分别获得不同时间节点健康对虾和对应时间点病害对虾的肠道细菌群落组成和丰度信息，剔除虾龄指示菌种的步骤；筛选初始健康状态下未定植于对虾肠道，但是随着对虾病害恶化相对丰度呈线性增长且其丰度显著高于对应时间点健康对虾的细菌类群，定义为多致病菌，确定多致病菌种类的步骤；筛选出ΔB‑0.5且ASCH‑score1.5的菌种为多致病菌的直接拮抗菌种，定义为益生菌的步骤；将单个益生菌相对丰度占所有益生菌相对丰度之和的比值作为相应益生菌的个体数量百分比，最终确定益生菌的组合和配比的步骤；优点是准确性更高、稳定性更好。

技术领域

本发明涉及水产养殖动物益生菌筛选方法，尤其是涉及一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法。

背景技术

随着我国对虾养殖业不断发展，养殖模式从土塘养殖转变为集约化、高密度的温棚和循环水养殖。这种转变导致应激原增多、对虾免疫力下降, 致使对虾养殖病害问题日益突出。对虾病害具有发病快、死亡率高等特点，而目前缺乏特别有效的治疗方法。我国每年因对虾病害造成的损失高达数百亿元。目前对虾病害的预防和治疗仍广泛采用抗生素。抗生素的滥用造成环境污染，诱导高耐药性病原菌的产生，同时破坏了对虾正常的肠道菌群使其更易受病原菌的侵染，最终通过食物链富集威胁到人类健康。利用自然环境中有益益生菌对水产养殖环境的生物修复，以此可部分取代抗生素的使用，同时减少养殖过程的换水频率。

现有商业化益生菌剂的设计缺乏科学依据，主要由芽孢杆菌和乳酸菌(人肠道益生菌)组成。然而，上述二种菌株在对虾肠道菌群中含量极低，甚至未检测到，表明不适宜在对虾肠道中定殖。由于宿主对肠道菌群的选择性，添加的商业益生菌未能持续成功地在对虾肠道中存活，因而未发挥预期的益生效果甚至无效。近期研究表明部分对虾养殖病害是多病原菌协同作用造成的，传统科赫法则（Koch's postulates）从发病对虾中分离到的菌株（高丰度的菌容易被分离到）有时并不能准确地反推出致病菌；同时多病原菌在侵染顺序和比例未知的前提下，难以在实验室依据科赫法则回复侵染宿主验证。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种准确性高的基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法，包括以下步骤：

（1）首先采用Illumina高通量测序方法分别获得不同时间节点健康对虾和对应时间点病害对虾的肠道细菌群落组成和丰度信息；

 （2）抽取对虾血液测定超氧化物歧化酶(SOD)浓度判断病害严重程度，即测定对虾血清中超氧化物歧化酶和溶菌酶活性，结合对虾病症和死亡率划分对虾疾病严重程度；

（3）筛选健康对虾生长过程中的虾龄指示菌种，从肠道细菌群落数据中剔除虾龄指示菌种，消除随生长阶段的本底变化；

（4）比较健康对虾和病害对虾肠道细菌组成动态差异，筛选初始健康状态下未定植于对虾肠道，但是随着对虾病害恶化相对丰度呈线性增长且其丰度显著高于对应时间点健康对虾的细菌类群，定义为多致病菌，将多致病菌特征序列通过与病原菌数据库比对确定多致病菌种类；

（5）计算最后一个时间分组的病害组中所有细菌的驱动种生态特征值ΔB和ASCH分值，筛选出ΔB-0.5且ASCH-score1.5的菌种为多致病菌的直接拮抗菌种，定义为益生菌；

（6）分别计算几种益生菌在最后一时间分组的健康组对虾肠道中的相对丰度比例，将单个益生菌相对丰度占所有益生菌相对丰度之和的比值作为相应益生菌的个体数量百分比，最终确定益生菌的组合和配比。

步骤（5）中驱动种生态特征值Δ B的计算方法如下：

（1）