[发明专利]用于检测鳗弧菌的TaqMan探针定量检测方法及相应的试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测鳗弧菌的TaqMan探针定量检测方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分鳗弧菌与其它种属的菌种或虫种，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测鳗弧菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对鳗弧菌进行TaqMan探针定量检测的方法及相应的检测试剂盒。

背景技术

鳗弧菌(Vibrio anguliiarum,Va)属弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌属(Vibrio)。该菌是第一个从海水鱼分离的致病菌，该菌为革兰氏阴性短杆菌，两端圆形，无荚膜，不形成芽孢，有运动力，极端单鞭毛，菌体大小为0.5-0.7um*1-2um。在普通琼脂培养基上形成圆形、隆起、半透明或不透明、灰白色、边缘整齐、有光泽的菌落。

鳗弧菌多为条件致病菌，是水环境微生物区系中的正常菌群，也是健康鱼类消化道中微生物区系的重要组成部分，但是一旦条件适宜时就成为致病菌。鳗弧菌曾经在世界范围内引起养殖鱼类的流行病暴发，到目前为止，已有十余个国家遭到鳗弧菌的肆虐，四十余种海水鱼受到鳗弧菌的侵袭。

鳗弧菌的感染途径有多种，主要包括皮肤、鳃、侧线以及肠道等。鳗弧菌的感染会引起全身性的组织病变。不停的鱼感染鳗弧菌后有不同的症状，但主要症状是体表出血。感染鳗弧菌的养殖牙鲆最明显的症状是鳍部严重出血以及体表溃烂。感染了鳗弧菌的大菱鲆，出现全身性的出血性败血症，鳍基部出血，眼球突出，角膜混浊，肝脏苍白，有时伴有腹水症状。

感染鳗弧菌后，目前没有有效的方法进行治疗，只能通过加强疫病监测与检疫，达到防控该病爆发的概率。国内外学者通过大量的研究，建立了一系列针对鳗弧菌的检测方法，如组织病理解剖法、电镜观察法、雷氏液体巯基乙酸盐培养法、PCR检测法及LAMP法。但是前三类方法操作复杂、耗时长及检测灵敏度低，只能对发病明显的鱼虾进行诊断；PCR检测法虽然结果准确，但检测时间长、操作复杂、无法定量，很难在生产用进行推广应用；LAMP法虽然检测时间快但假阳性高，达不到精确检测的要求。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测鳗弧菌的TaqMan探针定量检测方法，所述方法能够定量、快速、实时检测鳗弧菌，使鳗弧菌的检测更准确、灵敏、快速和安全。

具体地，上述方法包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、利用TaqMan探针定量检测检测鳗弧菌特异性基因empA基因；

S4、读取扩增Ct值；当所述鳗弧菌特异性基因empA基因的Ct值小于35 时，鳗弧菌的检测结果为阳性；当所述鳗弧菌特异性基因empA基因的Ct值大于35时，鳗弧菌的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述步骤S2中还包括设计empA基因的检测引物和TaqMan探针的步骤。

作为一种优选技术方案，所述鳗弧菌特异性基因empA基因的检测引物如

SEQ ID NO:1～2所示；

SEQ ID NO:1(5’-CAGGTGATGCTGATTTGTATGTCA-3’)；

SEQ ID NO:2(5’-CCGATTTGTAAGGGCGACAAT-3’)。

探针序列如SEQ ID NO:3所示；

SEQ ID NO:3(5’-FAM-CGGCAGCAAACCAACCACTTCTTCG-BHQ1-3’)。