[发明专利]一种同时检测酶促反应液中α-酮戊二酸和L-谷氨酸的方法

说明书

本发明涉及生物分析领域，具体讲，涉及一种同时检测酶促反应液中α‑酮戊二酸和L‑谷氨酸的方法。本发明采用高效液相色谱法，将酶促反应液注入到高效液相色谱仪中，采用C18柱分离，紫外吸收检测器进行检测。本发明实现了酶促反应液中α‑酮戊二酸和L‑谷氨酸含量的同时检测，可为α‑酮戊二酸生产的实时监测提供可靠的数据支持，检测样品不需要柱前或者柱后衍生化处理，极大缩短检测时间，检测结果更加准确。

技术领域

本发明涉及生物分析领域，具体讲，涉及一种同时检测酶促反应液中α-酮戊二酸和L-谷氨酸的方法。

背景技术

酮戊二酸(Ketoglutaric acid)是戊二酸的两种带酮基的衍生物，分为α型和β型两种。α-酮戊二酸大多数指的就α型。α-酮戊二酸是生命系统中基础代谢三羧酸循环的关键中间体之一，它调节许多基础代谢过程，并能为L-谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸等生物合成提供碳骨架。研究发现，α-酮戊二酸作为谷氨酰胺(Gln)的前体，可以为胃肠道细胞提供能量，促进胃肠道细胞增殖，协同维持胃肠道健康。它也是一种医药制剂、膳食补充剂和一种特殊的药用食品和饲料添加剂。

L-谷氨酸(L-glutamic acid,L-Glu)是一种酸性氨基酸，其化学名称为α-氨基戊二酸。L-谷氨酸在生物体的蛋白质代谢中起着关键作用，它还具有多种生理功能。例如，在医学上，其可改善儿童智力发育，可作为药物参与脑内蛋白质和糖的代谢，在体内与氨结合形成无毒谷氨酰胺，降低血氨含量，从而减轻肝昏迷症状。在食品工业中，是味精、香料、营养补充剂和生化试剂等生产的原料。同时，L-谷氨酸也是一种防止脱发的头发修复剂。L-谷氨酸用于皮肤，能有效治疗皱纹。

两者在各个领域中均有着重要的应用前景，市场需求量非常大。

采用化学合成方法合成α-酮戊二酸，但因其存在环境污染等一系问题，已逐步被淘汰。由于酶法可以获得单一结构、高纯度的产品而被广泛应用。利用发酵法生产制备α-酮戊二酸已成研究热点。采用该方法生产L-谷氨酸，需要建立一种适合L-谷氨酸、α-酮戊二酸分离和定量检测的方法，且该方法需具备准确、快速和简便等特点。

已有技术中没有采用高效液相色谱法同时测定发酵液中L-谷氨酸和α-酮戊二酸的含量的报导。目前，采用酸碱滴定法、分光光度法(李通化.因子分析—分光光度法在混合物组份分析中的应用α-酮戊二酸和丙酮酸的测定，分析化学，1987(10):29-34)和HPLC法(毛影、毕中周，HPLC法测定α-酮戊二酸的含量，中国药事，2008,22(10):895-896)测定α-酮戊二酸的含量。但是酸碱滴定法专属性差，测得结果不能正确反映出样品中α-酮戊二酸的含量而逐步被淘汰。分光光度法的检测结果准确性差、精度不高、检测时间长且只能检测发酵液中α-酮戊二酸的含量。已建立的HPLC法检测结果准确性好，但是不能同时检测发酵液中L-谷氨酸、α-酮戊二酸的含量。专利ZL201610395430.7(发明名称为用于检测α-酮戊二酸的电化学生物传感器、制备方法及其应用)应用电化学原理检测α-酮戊二酸含量，该方法在实际应用中实施困难。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种同时检测酶促反应液中α-酮戊二酸和L-谷氨酸的方法。本发明建立了一种准确便捷的方法，用于同时测定酶促反应液中α-酮戊二酸和L-谷氨酸的含量，能满足检测样品多，工作量大的生产企业。

为了实现该发明目的，采用的技术方案为：

本发明提出一种同时检测酶促反应液中α-酮戊二酸和L-谷氨酸的方法，所述方法采用高效液相色谱法，将酶促反应液注入高效液相色谱仪中，采用C18柱分离，紫外吸收检测器进行检测；

所述高效液相色谱法的流动相A为0.01～0.1mol/L磷酸氢二钾和0.001～0.01mol/L癸烷磺酸钠的混合溶液，pH值为1～5；所述高效液相色谱法的流动相B为无水乙醇。