[发明专利]一种高效诱导瓠瓜转基因发状根形成的方法

说明书

本发明公开了一种高效诱导瓠瓜转基因发状根形成的方法，属于植物基因工程技术领域。该方法首先用发根农杆菌菌液侵染植株地上部分外植体，进而通过GUS染色法和PCR扩增检测法对组合苗发状根进行阳性检测，综合考虑生根数、转化率和诱导率三个指标，筛选出最适宜进行发根农杆菌诱导的优异基因型材料。本发明利用种子萌发袋为载体，降低了污染的风险，所获得的毛状根系质量高、遗传稳定且所需时间大大缩短；建立的发根农杆菌诱导瓠瓜外植体高效获得瓠瓜组合苗的体系，填补了瓠瓜遗传转化技术的空白，为后续基因功能的研究以及加快瓠瓜育种速度打下基础。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种高效诱导瓠瓜转基因发状根形成的方法。

背景技术

瓠瓜是葫芦科葫芦属的一个栽培种，具有重要的园艺和药用价值。瓠瓜果实可用作蔬菜、容器、装饰品或器具等，其幼苗可作为甜瓜、西瓜、黄瓜等嫁接用砧木。瓠瓜起源于非洲，目前广泛栽培于热带至温带地区。我国瓠瓜栽培历史悠久，主要以嫩果作为蔬菜食用，是我国南方地区重要的瓜类蔬菜之一。

转基因技术是研究瓠瓜基因功能和性状改良的重要手段之一，但是像大多数作物一样，瓠瓜在转基因研究上一直存在着传统转化方法的障碍。传统转化方法主要以根癌农杆菌介导法为主，其次是发根农杆菌介导法。通过根癌农杆菌进行瓠瓜转基因非常困难，目前还未见报道，虽然利用发根农杆菌诱导携带目标基因的毛状根技术在南瓜等葫芦科作物中已得到了应用，但是在瓠瓜上尚未有诱导发状根形成的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述问题，提供一种高效诱导瓠瓜转基因发状根形成的方法。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：

一种高效诱导瓠瓜转基因发状根形成的方法，包括如下步骤：

(1)获得外植体：首先利用70％酒精对材料进行消毒，无菌水冲洗2-3遍后，播种于生化培养箱中进行黑暗催芽处理，待种子萌发后移栽到基质中并浇透水，置于光照培养箱中培养；待幼苗生长到第6d时，贴近根部将植株切断，获得地上部分作为外植体；

(2)发根农杆菌活化：使用时将发根农杆菌R1000活化、接种、培养，制备侵染用的发根农杆菌菌液；

(3)侵染外植体：取15-30mL的发根农杆菌菌液加入50mL小烧杯中，将外植体的茎段切口浸没到菌液中，侵染后移至生化培养箱中黑暗条件下共培养；

(4)以种子萌发袋为生长载体诱导发状根的形成：以无菌种子萌发袋为生长载体，将发根农杆菌侵染后的外植体沿着种子萌发袋的小孔插入其中，每隔一个小孔插入一个外植体，萌发袋中加入15-30mL的CIM培养基，密封保湿，将种子萌发袋置于配套的塑料支撑架上，用泡沫板夹紧；随后放于21℃培养箱内黑暗处理3d，3d后转移至光照培养箱中培养，培养2-4周后即可形成发状根。

进一步地，步骤(1)中，基质是由蛭石、草炭按照3：1的比例配制而成，且在121℃下高压灭菌20min。

进一步地，步骤(2)中，发根农杆菌R1000为携带GUS报告基因的双元表达载体pBI121。

进一步地，步骤(3)中，CIM培养基含有20％MS和0.4mM乙酰丁香酮。

进一步地，步骤(3)中，将外植体的茎段切口浸没到菌液中，侵染0.5-2h后，移至生化培养箱中黑暗条件下共培养。

进一步地，步骤(4)的整个过程在超净工作台中操作，黑暗处理期间保持植株适度萎蔫。

进一步地，步骤(1)及步骤(4)中，光照培养箱的生长参数设置为：温度28℃白天/22℃晚上，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度60％。

进一步地，步骤(4)中发状根通过GUS染色进行转基因发状根的阳性转化率检测。