[发明专利]一种利用滤膜实现外泌体富集的装置和外泌体富集方法

说明书

本发明涉及一种利用滤膜实现外泌体富集的装置及其应用，是一种可高通量，快速对体液中外泌体进行富集的装置。本发明的特点是利用抽滤原理选择与外泌体尺寸匹配的孔径的滤膜实现体液中外泌体的富集及其干扰成分的去除。该装置操作简单，处理通量大，可控制抽滤速度，可实现外泌体的快速富集。该装置可应用于血浆，尿液，细胞培养液等中的外泌体的获取。

技术领域

本发明涉及一种利用滤膜实现外泌体富集的装置，是一种可对多种体液及其他样本中的外泌体进行快速富集的装置。

背景技术

外泌体是由细胞分泌的一种囊泡，具有磷脂双分子层结构，尺寸在30-200nm之间，其中包含核酸，蛋白质等许多重要物质。广泛存在于血浆，尿液，细胞培养液，唾液，精液等中，与细胞间交流，信号传导及其疾病诊断诊疗等密切相关^[1]。近几年来，研究发现，可以参与癌症发生，及其作为治疗疾病的重要物质，因此被广泛的研究。

传统的外泌体的富集方法包含超速离心法，依赖聚合物沉降，依赖免疫亲和的方法^[2]等等。通常面临获取的时间较长，回收率低，外泌体纯度低，不能保证外泌体的完整性等各种问题。因此发展一种能够维持外泌体结构的快速，高回收率富集手段是十分必要的。

该装置是一种利用尺寸筛分原理通过滤膜拦截进行体液中干扰成分的去除外泌体的选择性富集的装置。该设备可以实现高通量、快速、高回收率、完整的外泌体的富集，在后续蛋白质组学研究中具有很好的应用前景。

参考文献

[1].Huilin Shao,et al.Chem.Rev.2018,118,1917-1950.

[2].Kaixiang Zhang,et al.ACS Sens.2019,4,1245-1251.

发明内容

本发明的目的是提供一种装置实现外泌体的富集，该功能的实现需要选择合适的滤膜，合适的抽滤装置及其相应的处理条件。

为实现上述的目的，本发明采用如下的技术方案。

(1)在密闭性较好的装置内装亲水性，孔径范围在5-100nm之间，尺寸大于抽滤装置砂芯尺寸的无机氧化铝(AAO)，聚碳酸酯，硝酸纤维素滤膜中的一种；

(2)外泌体富集的装置的使用过程为：用水，PBS或乙醇清洗好所有组件后，将5-100nm孔径的膜安装在器件中。打开泵后，用0.5-10mL水或者PBS等中性溶剂清洗膜，抽干后在膜上加入样品，进行抽滤。抽2-60min后，保证膜上残余液体为0-200μL。之后，加入体积为1-10mL的水，PBS，0.05-1M的氯化钠溶液，5-30％乙腈中的一种或两种以上进行膜的清洗，清洗1-5次，以尽可能多的洗掉杂质，膜上残余的样品即为收集的外泌体样品。

(3)对于滤膜上的外泌体的回收可分为以下两种方式：

(i)用干净的镊子取下滤膜放于试管内，用0.2-5mL水，磷酸盐缓冲液(PBS)，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)，3-8M尿素，4-7M盐酸胍，1-6％十二烷基磺酸钠(SDS)，0.1-2％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，1-4％十二烷基麦芽糖苷(DDM)溶液中的一种或两种以上反复吹打膜表面，之后利用超声破碎，在37-95℃高温煮膜即可得到含有外泌体的样品；

(ii)在器件上将膜反向安装，在膜反面上加入0.2-5mL水，磷酸盐缓冲液(PBS)，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)，3-8M尿素，4-7M盐酸胍，1-6％十二烷基磺酸钠(SDS)，0.1-2％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，1-4％十二烷基麦芽糖苷(DDM)溶液中的一种或两种以上，抽滤收集滤过的成分即为得到的外泌体样品。