[发明专利]一种雨生红球藻叶绿体表达系统及其应用

说明书

本发明涉及生物基因工程技术领域，是一种构建雨生红球藻叶绿体表达系统的方法。以雨生红球藻叶绿体基因组上SEQ ID NO:1所示序列和SEQ ID NO:2所示的序列为同源臂，以SEQ ID NO:3所示的序列、SEQ ID NO:4所示的序列为启动子，以SEQ ID NO:5所示的序列、SEQ ID NO:6所示的序列为终止子，以bar基因为筛选标记基因构建同源重组载体，并利用基因枪法将载体导入雨生红球藻细胞，经除草剂草丁膦筛选获得转基因藻株。采用本发明的雨生红球藻叶绿体稳定表达系统，可实现外源基因在叶绿体中稳定表达。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是一种雨生红球藻叶绿体表达系统及其应用。

背景技术

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种生活在淡水中的单细胞绿藻，隶属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属。虽然雨生红球藻是单细胞生物，其生活史却很复杂。通常其生长过程分为两个阶段，即游动细胞和不动细胞。游动细胞呈卵形或椭圆形，大小从5μm左右到20-30μm不等。原生质体和细胞壁之间存在较大的空间，二者通过很多分枝或不分枝的细胞质连丝相连，其间的空隙充满透明胶样物质。原生质体呈卵形，前端常呈乳头状突起。游动细胞具有两条顶生、等长鞭毛，鞭毛通过前端的叉状胶质管伸出细胞壁，在体外的长度约等于细胞体长。细胞核位于细胞中央，细胞核附近的一侧有一个眼点。叶绿体呈杯状、复杂的网状或颗粒状，具有典型的绿藻蛋白核。细胞壁由两层组成，内层主要是纤维素，外层为果胶质。游动细胞多呈绿色。不动细胞呈圆形，无鞭毛，不会游动，细胞大小变化幅度较大，平均直径为20-30μm。

雨生红球藻的营养繁殖为细胞分裂，产生2、4、8，甚至更多个子细胞。无性生殖为环境不良时，发育成厚壁孢子。对有性繁殖的存在及类型则一直存在争议。雨生红球藻有三种营养生长类型：(1)光合自养型，即利用光能吸收二氧化碳进行光合自养生长；(2)异养生长型，利用有机碳源如醋酸盐在黑暗条件下进行异养生长，但在在完全异养条件下生长，其生长速率、最大生物量都要低于光合自养与兼养方式；(3)混合营养型，即在光照条件下同时利用有机碳源和二氧化碳进行混合营养生长。在光照条件下加入醋酸钠，能明显促进雨生红球藻的生长，其生长速率约为光自养生长与异养生长速率之和。

雨生红球藻在胁迫或诱导条件下能大量积累类胡萝卜素，含量可占其干重的2％-5％，其中80％以上为经济价值很高的虾青素。雨生红球藻被认为是虾青素的最佳来源。尽管利用雨生红球藻生产虾青素具有广阔的发展前景，但在应用开发上还有许多关键技术和问题需要突破，如雨生红球藻对培养环境要求高、容易污染杂菌杂藻等；虾青素积累与生物量积累之间的矛盾等等。

利用遗传转化的方法来改良雨生红球藻的性状，是解决这些问题的一个重要途径。目前雨生红球藻的细胞核转化系统已经通过基因枪法、电击转化法以及农杆菌转染法构建完成，但是由于雨生红球藻基因组序列尚未完全测序，其结构复杂程度远大于大部分绿藻，使得细胞核转化系统的使用较困难，存在许多难题，如：难以定点突变，难以实现多个外源基因的表达，外源基因变异率高等。这种情况下，开发雨生红球藻叶绿体转化系统势在必行。

雨生红球藻含一个杯型叶绿体，其叶绿体基因组非常大，约1.1G。与其他红球藻叶绿体基因组相似，雨生红球藻叶绿体中基因分布非常分散，并且含有内含子的结构，且目前尚未发现多顺反子的结构。以上现象表明雨生红球藻叶绿体具有一些真核性质，原核表达特征的叶绿体转化系统是否适用尚未可知。目前尚未有该藻叶绿体表达系统的研究报道，这严重阻碍了该藻的进一步研究和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种雨生红球藻叶绿体表达系统及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种雨生红球藻叶绿体表达系统，表达系统包括同源臂，启动子和终止子，同源臂含SEQ ID NO:1所示序列的上游同源臂和SEQ ID NO:2所示序列的下游同源臂。