[发明专利]一种用于大熊猫犬瘟热病毒检测的引物、探针及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于大熊猫犬瘟热病毒检测的引物、探针及试剂盒，引物及探针的设计以大熊猫源犬瘟热病毒giant panda/SX/2014株(Genbank：KP793921)为模板，旨在提高检测特异性，与犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬轮状病毒(CRV)等其他病毒不存在交叉反应，在用于大熊猫犬瘟热病毒检测时，灵敏度高，检出限为5×10¹拷贝/μL，检测结果稳定可靠，与现有RT‑PCR方法具有很高的符合度，可以实现便携式的现场快速诊断。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合核酸检测试纸条检测犬瘟热病毒的引物、探针及试剂盒。

背景技术

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)感染引起的犬和其他肉食动物的一种急性、高度接触性传染病。犬瘟热最初被描述为一种犬的传染病，随着病毒的不断进化和跨种传播，近年来CDV的宿主范围不断扩大，已由传统的犬科、浣熊科和鼬科扩展到猫科、灵猫科等所有陆地食肉目动物及非人灵长类动物。自1809年首次报道以来，该病呈现全球范围内流行的趋势，给伴侣动物、经济动物和野生物动物造成了严重的影响。近10年来，不断有犬瘟热在狮子、老虎等多种野生动物种群暴发的报道。随着CDV宿主范围的不断扩大，犬瘟热已成为威胁大熊猫种群数量和生命安全的第一大传染病。最早于1997年，重庆动物园共有3只大熊猫感染CDV，2只死亡。2014年12月-2015年4月，陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心22只圈养大熊猫暴发犬瘟热疫情，先后有6只CDV核酸检测呈阳性，其中5只大熊猫抢救无效相继死亡，给整个大熊猫种群带来了极大的威胁。犬瘟热导致的临床症状非常广泛，和其他疫病导致的临床症状相似，尤其是大熊猫、虎、猴子等野生动物表现有独特的临床特点，从而难以从临床症状上对犬瘟热进行有效诊断。整个疫情期间，大熊猫临床样品犬瘟热的诊断主要依赖于国家林业局(长春)野生动物疫病研究中心的PCR检测，需要克服长距离冷链运输样品。因此，适用于临床的快速的、灵敏的、特异的犬瘟热诊断方法已成为专业人员开展临床感染调查、及时制定隔离措施、防止疫情扩散和控制疫情的有力工具和必备条件。

CDV在分类上属副黏病毒科、麻疹病毒属，是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，基因组依次排列为3’-UTR-N-P(C,V)-M-F-H-L-UTR-5’，共编码核衣壳蛋白基因(N)、磷蛋白基因(P)、基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)、血凝素蛋白基因(H)、大聚合酶蛋白基因(L)，其中P基因还可通过RNA编辑和翻译起始位点的改变形成两个非结构蛋白C和V，在CDV所有结构蛋白中N蛋白的保守性最高，因此，N基因被广泛用于诊断方法的开发中。

目前用于犬瘟热病毒的检测方法主要包括病原的分离鉴定、血清学方法和分子生物学的方法。病毒分离鉴定是最传统的检测方法，其特异性强，结果真实可靠，但是在实际操作中费时费力且敏感性低，因此，在临床应用中具有一定的局限性；血清学方法如酶联免疫吸附实验、中和试验、免疫荧光试验等需要制备特定抗原蛋白或特异性抗体，并且操作程序繁琐，不适合现场临床检测；针对犬瘟热病毒分子生物学检测方法主要有RT-PCR方法、荧光定量PCR方法、RT-LAMP方法等，但这些方法均需要精密的仪器设备和专业的技术操作人员，难以满足非实验室环境下野外或基层现场检测要求，因此，亟需建立一套快速、准确、简便的诊断方法，为现场检测、病原的监测及疫情预警提供新型的检测技术与物质基础。