[发明专利]非洲猪瘟病毒p72重组蛋白、单克隆抗体及试纸

说明书

本发明提供非洲猪瘟病毒p72重组蛋白、单克隆抗体及试纸。非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列以柔性氨基酸片段连接得到，免疫原性强、特异性强；还提供了编码该重组蛋白的核苷酸序列；还提供利用该重组蛋白免疫动物得到的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白单克隆抗体；还提供了保藏编号分别为CGMCC No.18540和CGMCC No.18539的杂交瘤细胞7A7和3E5，对非洲猪瘟病毒p72灵敏度高，特异性强；还提供了包括该重组蛋白抗体的乳胶微球检测试纸、胶体金检测试纸，批次差异小，检测灵敏度高，操作简单。

技术领域

发明属于动物疫病检测技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒p72重组蛋白、核苷酸序列、单克隆抗体、杂交瘤细胞、试纸。

背景技术

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）所引起的猪的一种出血性、高致死率、病毒性传染病。所有的日龄的猪都易感染。ASF自然感染的潜伏期长，自然感染为4~19天。感染后平均死亡时间为2-10天，临床上表现形式有高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血等，其临床症状与猪瘟、猪丹青病毒相似。猪或者野猪感染非洲猪瘟病毒后，其潜伏期通常为3-15d，强毒株感染的死亡率可达到100%，世界动物卫生组织（OIE）认为，在ASF流行疫区和低毒力ASFV感染初期地区进行调查、诊断，血清学方法是首推的诊断方法，而以纯化获得的重组蛋白作为检测原，优势明显。

非洲猪瘟病毒属于非洲猪瘟病毒属，是双链DNA病毒，也是唯一的虫媒DNA病毒。ASFV基因组为末端共价闭合的双股线状DNA，长度为170 kb~190 kb，具有末端交联和反转重复区，其编码151-167种蛋白，成熟的病毒粒子包含有约50多种结构蛋白。其中由p72结构蛋白组成的核衣壳蛋白含量占到全部病毒蛋白的1/3，是结构蛋白中含量最多的。p72存在于病毒衣壳的表面，具有较好的免疫原性和抗原性，能够诱导机体产生中和抗体，因而是血清学检测的主要抗原区，也是用于ASFV诊断检测的主要蛋白，为建立无感染性的、快速、灵敏的血清学检测方法奠定了基础。在抗原抗体的结合反应中，抗原参与结合的部位称为抗原的表位，抗原表位是蛋白质抗原性的基础，目前技术中普遍采用的抗原表位肽，免疫原性仍较弱、特异性较差，因此亟需一种免疫原性强、特异性好的非洲猪瘟病毒p72重组抗原蛋白，并可依此重组抗原蛋白制备与其结合的单克隆抗体或多克隆抗体，还可进一步利用得到的抗体对非洲猪瘟病毒进行检测。

此外，传统的诊断检测非洲猪瘟病毒的方法有分子生物学方法、酶联免疫试剂盒方法，其中分子生物学方法以聚合酶链式反应（PCR）为代表，通过检测病毒分子来确认动物是否被感染，其操作繁琐，试剂和设备昂贵，对于猪场来说难以操作；酶联免疫法利用96孔酶标板为载体，以抗原抗体特异性反应为原理检测动物是否感染ASF病毒，具有灵敏度高、特异性好等特点，美中不足的是操作过程较为繁琐，加样精准度要求高，且需要酶标仪、恒温箱等实验设备来确保反应环境，基层养殖场、特别是现场检测时难以开展；以上方法均不能达到快速检测的目的。目前使用最广泛的是胶体金检测试纸条，同样利用抗原抗体反应原理，检测非洲猪瘟病毒抗原，其操作简便、反应时间短，但缺陷是灵敏度不够高，可能存在假阴性或者假阳性，特别针对ASFV的快速检测时，由于样品多是全血、组织样本等，样本成分复杂，无法进行长时间前处理，使得试纸条可能出现干扰、特异性差等问题，难以满足快速检测ASFV的要求。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供非洲猪瘟病毒p72重组蛋白、核苷酸序列、单克隆抗体、杂交瘤细胞及试纸，重组蛋白具有强的免疫原性和特异性，抗体具有很强的特异性，检测试纸灵敏度高。