[发明专利]一种果胶酶人工序列及其表达方法和应用

权利要求书

1.一种人工合成的果胶酶基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的果胶酶基因的应用，其特征在于，所述应用为构建重组载体、表达盒或重组菌。

3.一种权利要求1所述的果胶酶基因编码所获得的果胶酶在果汁澄清中的应用。

4.一种重组果胶酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列重组构建到pPICZα载体中，经转化到毕赤酵母宿主菌细胞中并用1000 μg/mL Zeocin的YPD平板筛选得到高Zeocin抗性的转化子；

步骤二、所得的转化子用BMGY培养基培养至OD₆₀₀为10~12，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1~2%，诱导1~3 d，筛选高水平分泌表达果胶酶的转化子；

步骤三、高水平分泌表达果胶酶的转化子用BMGY大量生长培养，之后用BMMY培养基重悬细胞并在28℃继续诱导培养，补加甲醇使其质量分数保持在1~2%。

5.如权利要求4所述的重组果胶酶的制备方法，其特征在于，还包括步骤四，蛋白纯化：

用DEAE离子交换柱对步骤三中BMMY培养基的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将经过透析去除离子并调节pH的上清液过柱，用含30 mM NaCl的pH 8.0缓冲液漂洗柱子，然后用含100 mM NaCl的pH 6.0 缓冲液溶液将目标蛋白洗脱下来即可。