[发明专利]一种硝基还原酶响应的乏氧探针化合物及其制备与应用

说明书

一种硝基还原酶响应的乏氧探针化合物及其制备与应用。本发明涉及一种可响应硝基还原酶的荧光探针化合物(I)制备方法，以及其在乏氧分析与成像中的应用。本发明荧光探针可实现对肿瘤微环境乏氧相关硝基还原酶的高灵敏、高特异性的响应；其次，该化合物通过缩合反应制得，分子的共轭程度明显提高，从而吸收和荧光发射波长较香豆素和罗丹明等染料发生明显红移，所以乏氧探针进行分析与成像应用时，干扰更小；该探针通过分子内电荷转移机制(ICT)构建，为信号增强型探针，背景信号较小。。

(一)技术领域

本发明涉及一种可响应硝基还原酶的荧光探针化合物制备方法，以及其在乏氧分析与成像中的应用。

(二)背景技术

近年来，人们对癌症的研究越来越深入，发现肿瘤微环境对肿瘤的发生、发展和转移起着重要作用。肿瘤微环境与具有明显个体差异的肿瘤细胞本身相比，相对比较稳定，不易受环境因素影响，不易产生抗药性，具有重要的研究意义。肿瘤微环境主要具有乏氧、微酸性环境、还原性环境、特定生物酶表达上调等特点。肿瘤微酸环境是由癌细胞对葡萄糖的高代谢并生成酸性的乳酸产物造成的。此外，肿瘤细胞的生长速度远快于其内部血管的产生速度，而且快速生长的肿瘤细胞需要从周围血管中吸收更多的氧气和营养物质来满足其生长需要，从而很容易在实体肿瘤中产生乏氧区域。肿瘤区域乏氧细胞的一个重要特征是还原酶高表达，主要包括硝基还原酶、醌还原酶、偶氮还原酶等。若不考虑这些微酸性、还原性、乏氧等肿瘤微环境因素，只基于体外细胞水平的研究构建癌症诊断与治疗方法，将其应用于动物和人体时，往往不能获得良好的重现效果。因此，对肿瘤微环境进行成像研究具有重要理论意义与应用前景。

荧光成像技术的发展离不开荧光探针的支持。基于荧光探针的荧光成像技术由于具有可视化、原位、无损等优点，广泛应用于细胞及活体水平的生物成像分析。常用的荧光探针中，小分子荧光探针因其具有容易合成与修饰、光谱易调节、荧光量子产率高、生物相容性良好等优点，可通过分子内电荷转移(ICT)、光诱导电子转移(PET)、荧光共振能量转移(FRET)等各种不同的原理构建灵敏度高、选择性好、响应性快的荧光探针，从而实现对特定目标物质的响应性研究。例如，罗丹明类染料具有荧光量子产率高、摩尔吸收系数大、光稳定性好、pH适用范围广、生物相容性好等优点。此外，罗丹明的“关-开”响应机理能够用于构建各种增强型荧光探针，能够很好的避免背景荧光的干扰，从而被广泛应用于各种生物分子的分析与检测。

分子内电荷转移(ICT)是指具有推拉电子结构的分子在激发态时发生分子内电子转移，形成分子内正负电荷分离的过程，其宏观表现是光谱的红移或者蓝移。其基本原理是荧光探针中的荧光团两端分别以共轭键形式连接供电子基团和吸电子基团而形成具有“推拉”作用的共轭体系。当电子基团中的识别单元与目标分子相互作用时，对荧光团性能产生影响从而造成光谱变化。利用含羟基的香豆素衍生物与4-二乙氨基酮酸一起制备能够用于构建响应型荧光探针的荧光染料,该荧光染料可通过分子内电荷转移机制(ICT)构建能够特异性响应乏氧相关硝基还原酶的增强型荧光探针，从而进行生物分析与荧光成像。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种可响应硝基还原酶的荧光探针化合物制备方法，以及其在乏氧分析与成像中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种可响应硝基还原酶的荧光探针化合物，其结构如式(I)所示：

本发明还涉及制备所述的荧光探针化合物的方法，所述方法包括：

(1)式(II)所示含羟基的香豆素衍生物与式(III)所示4-二乙氨基酮酸溶于磺酸并在90～100℃搅拌反应10～20小时，冷却到室温后加入水，抽滤所得固体分离纯化，得到式(VI)所示中间体；

(2)式(VI)所示中间体溶于N，N-二甲基甲酰胺，然后加入碳酸钾和硝基苄溴，并在50～60℃搅拌反应12～18小时，反应完全后加入水，抽滤所得固体分离纯化，得到式(I)所示荧光探针化合物。