[发明专利]一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用

说明书

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用。本发明采用单管双荧光通道同时检测永安河病毒和内参基因Rnase P的存在，能检测全血、血清、脑脊液、粪便和组织等标本中永安河病毒RNA的存在。本发明检测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高；在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析，定量线性范围好；检测灵敏度高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好，精密度高；能通过内参基因的检测结果对样本的提取和扩增整个过程进行质量监控。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用。

背景技术

永安河病毒(Ljungan virus)属于小核糖核酸病毒科、副肠孤病毒属，是1999年被发现的一种人畜共患病毒，能在人和啮齿内动物之间相互传播感染，永安河病毒感染可导致胎儿发育畸形、胎儿死亡、新生儿突发死亡和心肌炎等，同时也发现永安河病毒感染与糖尿病具有显著相关性。

但是，目前针对永安河病毒的检测方法主要还是传统的电镜观察、血清中和等，这些检测方法均存在操作繁琐、周期长，特异性差等弊端，急切需要开发一种新的能够快速且准确对病毒进行鉴定的方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，包括永安河病毒特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.1-3；内标基因Rnase P特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.4-6。

一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测引物和探针。

进一步地，还包括：

阳性对照品：永安河病毒标准品；

内标溶液：含Rnase P序列的病毒样颗粒溶液；

阴性对照品：RNase Free H₂O。

一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括：以样品RNA为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括权利要求1所述的永安河病毒的实时荧光定量PCR检测引物对和探针。

进一步地，所述扩增反应体系包括：样品模板、权利要求1所述的永安河病毒的实时荧光定量PCR检测引物和探针、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；扩增程序为：40℃15min；95℃5min；95℃15sec、58℃45sec，45个循环。

进一步地，对扩增曲线进行分析判断原则为：

当FAM荧光通道中Ct≤40时，判断样品为永安河病毒阳性；

当FAM荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为永安河病毒阳性，否则判断样品为永安河病毒阴性；

当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道中Ct≤45时，判断样品为永安河病毒阴性；

当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA和重新扩增。

如权利要求1所述的一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针在制备用于检测永安河病毒病毒的试剂盒中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：