[发明专利]一种快速鉴定家蚕精巢中有核精子和精原细胞的方法

说明书

本发明属于昆虫生物学领域，具体涉及一种快速鉴定家蚕精巢中有核精子和精原细胞的方法。该快速鉴定家蚕精巢中有核精子和精原细胞的方法为：先将解剖得到的家蚕精巢置于TC‑100完全培养基中去除精巢表面粘附组织后，撕开所述家蚕精巢，对含有有核精子和精原细胞的样品进行涂片、固定、染色操作后置于荧光显微镜下观察。本发明的快速鉴定家蚕精巢中有核精子和精原细胞的方法在操作过程中可有效维持有核精子和精原细胞的完整轮廓，在荧光显微下拍照观察即可实现有核精子和精原细胞的鉴定。

技术领域

本发明属于昆虫生物学领域，具体涉及一种快速鉴定家蚕精巢中有核精子和精原细胞的方法。

背景技术

精子一直是生理学家、形态学家和细胞生物学家研究的热点。典型的精子细胞由头部(细胞核顶体)、颈部(线粒体鞘)和尾(中心体)三部分组成。精子在进化理论的发展中具有重要作用。

家蚕和其它鳞翅目昆虫一样具有精子二型性，即可由精原细胞发育出有核精子和无核精子。有核精子可以使卵受精并发育成个体，而无核精子不能使卵受精，在有核精子受精过程中起辅助作用。有核精子和无核精子都是由同样基因型的精原细胞发育而来，但是它们在形态、大小、数量、结构等方面具有很大差异。研究表明，在受精过程中，无核精子先于有核精子进入雌蛾交配囊内，为有核精子提供营养及能量。因此，无核精子在有核精子受精过程中起着重要的作用。

为了研究家蚕精子二型化的形态学发生，必须寻求一种简便、高效的鉴定方法，本发明中快速鉴定家蚕精巢中精子和精原细胞的方法，对进一步研究精子二型性分化具有重要意义。目前，相关的研究较少。文献《Dimorphic sperm formation by Sex-lethal》(Hiroki Sakaia,Hiroyuki Oshimab,Kodai Yuric等，[J].PNAS,2019,116(21):10412-10417)公开了在对家蚕的精细胞进行观察时采用多聚甲醛固定，同时用DAPI染色的方法，但该法精巢在PBS溶液中解剖让精子游离出来，同时固定和染色时间长达1h，非常耗费时间。

发明内容

发明人在研究过程中发现PBS会造成有核精子和精原细胞的破裂，使得不能清楚地看到两种细胞的完整轮廓，进而不能实现辨别有核精子和精原细胞的目的。本发明通过先将精巢置于TC-100完全培养基中去除精巢表面粘附组织，再进行固定和染色的操作，可有效维持有核精子和精原细胞的完整轮廓，实现在荧光显微镜下拍照观察即可分辨有核精子和精原细胞的目的。

本发明的快速鉴定家蚕精巢中有核精子和精原细胞的方法采用如下技术方案：一种快速鉴定家蚕精巢中有核精子和精原细胞的方法，先将解剖得到的家蚕精巢置于TC-100完全培养基中去除精巢表面粘附组织后，撕开所述家蚕精巢，对含有有核精子和精原细胞的样品进行涂片、固定、染色操作后置于荧光显微镜下观察。

优选的，将从TC-100完全培养基中取出的、剥离干净的家蚕精巢放在载玻片上，撕开小口，用镊子从一侧压住(轻压，尽量避免对细胞的损坏)，使有核精子和精原细胞游离出来，涂匀，室温放置至样品干燥后，对所述有核精子和精原细胞进行固定、染色。

优选的，将从TC-100完全培养基中取出的、剥离干净的家蚕精巢再置于TC-100完全培养基中，撕开所述家蚕精巢，使家蚕精巢内容物释放于所述TC-100完全培养基中，得到含有有核精子和精原细胞的培养液，取所述含有有核精子和精原细胞的培养液涂片、固定、染色后置于荧光显微镜下观察。

优选的，所述TC-100完全培养基中还含有FBS，所述FBS的终浓度为10wt％。在TC-100完全培养基中添加FBS可模拟体外细胞培养的条件，有助于确保解剖出的有核精子和精原细胞保持原始形态，不会破裂分解。

优选的，采用4％多聚甲醛PBS溶液进行固定，采用10μg/ml DAPI水溶液进行染色。

优选的，所述4％多聚甲醛PBS溶液的固定时间为5min。