[发明专利]一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用

说明书

本发明提供了一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用，属于基因工程技术领域；所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的天冬氨酸酶突变体是在天冬氨酸酶(氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)的基础上，将第427位谷氨酸突变成了谷氨酰胺。本发明通过将天冬氨酸酶的第427位氨基酸残基突变成谷氨酰胺，改变了活性位点附近的极性环境，更有利于底物反应时的氨供给，从而提高酶活，加强了该酶合成β‑氨基酸的能力，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用。

背景技术

β-氨基酸在制药工业上是广泛应用的靶分子，是生物活性化合物或天然产物和药物的结构单元。其中β-氨基丁酸是一种有效的引发剂，可在至少40种植物物种中提供广谱性疾病保护。另外β-氨基丁酸可以作为医药中间体β-氨基丁醇的前体物质。β氨基丁醇是一种治疗艾滋病药物杜鲁特韦(Dolutegravir)的关键中间体。

天冬氨酸酶的天然底物是天冬氨酸，以高底物特异性和二级羧酸盐结合口袋的特性被选择改造用于β-氨基酸的制备。但目前的天冬氨酸酶对反应的pH值和温度的条件要求苛刻，依赖高温强碱的反应环境，在温和条件下酶活较低，这一缺陷导致β-氨基酸生产成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用，本发明的天冬氨酸酶突变体在温和条件下的酶活提高，能够提高制备β-氨基酸的反应效率，同时降低反应成本。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种天冬氨酸酶突变体，所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种编码上述方案所述天冬氨酸酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种上述方案所述基因的重组表达载体。

优选的，所述重组表达载体以pET21a作为原始表达载体。

本发明还提供了一种包括上述方案所述重组表达载体的重组菌。

优选的，所述重组菌以大肠杆菌作为宿主菌。

优选的，所述大肠杆菌包括E.coliBL21。

本发明还提供了上述方案所述天冬氨酸酶突变体或所述基因或所述重组表达载体或所述重组菌在制备β-氨基酸中的应用。

优选的，所述β-氨基酸包括β-氨基丁酸。

本发明的有益效果：本发明提供了一种天冬氨酸酶突变体，所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的天冬氨酸酶突变体是在天冬氨酸酶(氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)的基础上，将第427位谷氨酸突变成了谷氨酰胺。本发明通过将天冬氨酸酶的第427位氨基酸残基突变成谷氨酰胺，改变了活性位点附近的极性环境，更有利于底物反应时的氨供给，从而提高酶活，加强了该酶合成β-氨基酸的能力，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。试验结果表明，在不同pH条件下本发明的天冬氨酸酶突变体比天冬氨酸酶的酶活均有所上升，在pH 8.0时比酶活提高1.36倍；在pH 9.0时二者以底物巴豆酸进行全细胞转化，本发明的天冬氨酸酶的催化效率明显提高，8h时天冬氨酸酶突变体对巴豆酸转化率达95％，β-氨基丁酸产量达228.28g/L。另外，在不同温度下本发明的天冬氨酸酶突变体比天冬氨酸酶的酶活均有所提高，其中在37℃下提高最多，为1.4倍。

附图说明