[发明专利]一种间充质干细胞无支架三维凝胶干性鉴定方法

说明书

本发明涉及干细胞和再生医学领域，具体涉及一种间充质干细胞无支架三维凝胶干性研究方法。间充质干细胞经过凝胶诱导培养7天获得间充质干细胞无支架三维凝胶，分别接种于成脂、成骨或成软骨诱导培养基中诱导培养14天，每72‑96h换液，培养环境为37℃、5%CO₂培养箱，分化诱导后油红O进行成脂染色鉴定、茜素红进行成骨鉴定、阿利新蓝进行成软骨染色鉴定。本发明提供了一种验证药物诱导获得的间充质干细胞凝胶仍保持间充质干细胞多向分化能力具有干性的方法。本发明的方法对脐带、脂肪、骨髓、脐血来源的间充质干细胞凝胶干性均可验证。

技术领域

本发明涉及干细胞和再生医学领域，具体涉及一种间充质干细胞无支架三维凝胶干性研究方法。

背景技术

间充质干细胞是存在于体内多种组织中的一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。由于具有容易分离扩增、自我更新、多向分化和低免疫原性等特性，而成为了目前组织工程和再生医学中理想的种子细胞，为一些传统药物治疗困难的疾病带来新希望。

对工程软骨移植术来讲，选择合适的间充质干细胞为种子细胞，建立恰当的细胞增殖和分化培养体系构建生物工程软骨，是治疗关节损伤的关键步骤。许多研究都将焦点集中到寻找合适的培养骨架上，而这些骨架往往是合成高分子材料或者生物材料，而其在人体内长期存在，对机体是否有不良作用还不明朗。目前，几种骨架材料已经进入临床应用，而其长期存在体内的安全性仍然需要跟踪。除此之外，关节软骨细胞由于其独特的矩阵结构，使软骨具有抗粘附的特性，此特性也成为临床中工程软骨移植治疗软骨损伤的一个难点。为了克服这一难点，临床上通过用酶处理软骨基质表面增加其粘着性，或者通过缝合将移植组织强制固定，或者用可溶性针将其固定。然而，这些方式都会对软骨造成二次损伤，并有动物实验证明这些缝合处的软骨并不会自动愈合，并且会引起周围基质组织的退行降解。因此，移植组织对软骨的粘附能力成为治疗软骨损伤的一个重要部分。

一种间充质干细胞无支架三维凝胶可以用于替代组织工程软骨，并可以很好解决上述问题。然而，凝胶中的间充质干细胞是否仍具有干细胞的特性成为重点。如何研究间充质干细胞凝胶中间充质干细胞的干性成为本发明主要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种间充质干细胞凝胶干性的鉴定方法，凝胶干性研究方法主要研究其中间充质干细胞的成脂、成骨、成软骨分化能力。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

采用如下步骤：

间充质干细胞经过凝胶诱导培养7天获得间充质干细胞无支架三维凝胶，分别接种于成脂、成骨和成软骨诱导培养基中诱导培养14天，每三天换液，培养环境为37℃、5% CO₂培养箱。

进一步的，所述的染色鉴定为：采用油红O进行成脂分化鉴定，当细胞内油滴被染为亮红色时为间充质干细胞保持向脂肪细胞分化能力；采用茜素红进行成骨分化鉴定，当钙沉淀被染为红色或产生钙结节时为间充质干细胞能够诱导分化为骨细胞；采用阿利辛蓝染色鉴定进行成软骨分化鉴定，当软骨细胞微球被染为亮蓝色时为间充质干细胞保持分化为软骨细胞的能力。

进一步的，间充质干细胞在上述2-3种染色成阳性反应时，说明间充质干细胞保持干性。

进一步的，间充质干细胞的来源为脐带、脂肪、骨髓或脐血；

进一步的，成脂诱导培养基配方为含5% ultroGRO +10mg/mL 胰岛素 + 1µM 地塞米松+ 100µM 吲哚美辛 + 500µM IBMX的达优MSCBM培养基；

进一步的，所述成骨诱导培养基的配方为含5% ultroGRO +0.1µM 地塞米松 + 50µM抗坏血酸 + 10mM β-甘油磷酸的达优MSCBM培养基；