[发明专利]一种马来酸水合酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种马来酸水合酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，与野生型马来酸水合酶相比，显著提高了催化马来酸一步水合反应生成D‑苹果酸的酶活力。采用表达该马来酸水合酶突变体的全细胞催化100g/L马来酸底物反应生成D‑苹果酸时，产物光学纯度超过99％，具有工业化开发应用前景。

技术领域

本发明属于酶催化技术领域，具体地说，涉及一种马来酸水合酶突变体、及其用于酶法催化马来酸水合反应生产D-苹果酸的用途。

背景技术

D-苹果酸，CAS 636-61-3，分子量134，又称2-羟基丁二酸，是自然界中稀有的有机酸，其在医药工业中有广泛的用途，D-苹果酸作为手性前体主要用于手性药物的合成，可用作原料合成抗生素、抗病毒药物、抗组胺药物等。D-苹果酸的合成方法，一般可利用不对称合成法、消旋体物理拆分法和生物法进行合成制备。已有的生物法，主要是天然微生物拆分法和全细胞转化法，两种方法都存在所用微生物难以高密度发酵、底物转化率低和产品光学纯度低等问题，造成工业化生产成本较高，无法满足市场需求。

众所周知，富马酸(Fumaric acid)和马来酸(Maleic acid)都是丁烯二酸，两者的区别在于立体结构不一样，富马酸是反丁烯二酸，呈反式结构；马来酸是顺丁烯二酸，呈顺式结构，两者的酸性是不同的。马来酸又称为失水苹果酸。

研究发现，有些富马酸水合酶(fumC)也能够催化马来酸进行水合反应来产生D-苹果酸，受此启发，我们对于各种来源的富马酸水合酶进行了筛选和比较，发现光合细菌荚膜红假单孢菌(Rhodopseudomonas capsulata)来源的富马酸水合酶fumC具有上述催化功能，但催化效率不高，判断为酶活力低造成的，因此有必要对该酶进行改造，以期获得高酶活力的突变体。

发明内容

为了探索酶催化法制备D-苹果酸的工业化可行性，本发明利用基因工程技术来对一种光合细菌荚膜红假单孢菌(Rhodopseudomonas capsulata)来源的富马酸水合酶fumC基因(氨基酸序列参见UniProtKB-A0A507ZEG8)进行定向进化，筛选高酶活性的突变体，从而有利于实现酶法生产D-苹果酸的工业化。

为此，本发明通过随机突变、半理性设计等技术对野生型富马酸水合酶fumC或称野生型马来酸水合酶(SEQ ID NO:1)进行改造，获得高酶活力的马来酸水合酶突变体，以便高效地将马来酸催化生成D-苹果酸。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种高酶活力的马来酸水合酶突变体。

本发明的第二个目的在于提供编码上述马来酸水合酶突变体的基因。

本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。

本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。

本发明的第五个目的在于提供上述突变体或微生物在生产中的用途。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种马来酸水合酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1第78位的T替换为N、第138位的Q替换为P、第150位的V替换为A、第312位的P替换为S的突变体，氨基酸序列为：