[发明专利]一种克隆法尼基转移酶基因家族成员群的方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种克隆法尼基转移酶基因家族成员群的方法。本发明的克隆法尼基转移酶基因家族成员群的方法，包括步骤：1)选取细菌一；2)扩增细菌一的部分法尼基转移酶基因引物采用第一简并引物，模板为细菌一的基因组；3)将扩增得到的部分法尼基转移酶基因做比对，获得亲缘关系最近的菌种并获得其的完整法尼基转移酶的基因序列；4)根据亲缘关系最近菌种的完整法尼基转移酶基因序列设计第二简并引物，扩增细菌一的完整法尼基转移酶基因，模板为细菌一的基因组；5)按照该方法依次得到多个细菌的完整法尼基转移酶基因，建构法尼基转移酶基因家族成员群。本发明的方法能够获取大量的法尼基转移酶基因家族成员。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种克隆法尼基转移酶基因家族成员群的方法。

背景技术

法尼基转移酶是他汀类药物生产的重要催化剂，获取法尼基转移酶基因家族成员能为法尼基转移酶基因研究和他汀类药物生产提供丰富的候选基因资源。目前，克隆法尼基转移酶基因家族成员的方法是首先在基因库中确定法尼基转移酶基因序列，然后根据法尼基转移酶基因序列设计引物克隆已知菌种的法尼基转移酶基因；这种方法获取的法尼基转移酶基因十分有限，仅局限于基因库中已公开的法尼基转移酶基因，不能获取未公开在基因库中法尼基转移酶基因，这种方法不能全面获取法尼基转移酶基因家族成员。

发明内容

为了解决以上问题，本发明的目的是提供一种克隆法尼基转移酶基因家族成员群的方法，能够获取大量的法尼基转移酶基因家族成员，为法尼基转移酶基因研究和他汀类药物生产提供丰富的候选基因资源。

为实现上述目的，本发明所设计的克隆法尼基转移酶基因家族成员的方法，包括步骤：

(1)选取细菌一；

(2)利用PCR技术扩增细菌一的部分法尼基转移酶基因，PCR 扩增技术中引物采用第一简并引物，第一简并引物的上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示，模板为细菌一的基因组DNA；

(3)将扩增得到的部分法尼基转移酶基因做BLAST比对，获得亲缘关系最近的菌种并获得亲缘关系最近菌种的完整法尼基转移酶的基因序列；

(4)根据步骤(3)亲缘关系最近菌种的完整法尼基转移酶基因序列设计第二简并引物，利用PCR技术扩增细菌一的完整法尼基转移酶基因，该步骤的PCR扩增技术中引物为第二简并引物，模板为细菌一的基因组DNA；

(5)再选取细菌二，按照上述步骤(2)至步骤(4)的方法获取细菌二的完整法尼基转移酶基因，按照该方法依次得到多个细菌的完整法尼基转移酶基因，建构法尼基转移酶基因家族成员群。

作为优选方案，所述步骤2)和步骤4)中PCR扩增体系为10× PCR反应缓冲液5μl、25mmol/L Mgso4 2μl、10mmol dNTP 5μl、 10nmol/L引物各1μl、模板80ng、KoD-Plus DNA聚合酶1μl、双蒸去离子水定容至50μl；反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃ 30s，68℃延伸1.30min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。

本发明的优点在于：本发明利用第一简并引物克隆出细菌一法尼基转移酶基因的部分碱基序列，将扩增得到的部分法尼基转移酶基因做BLAST比对获得亲缘关系最近的菌种并确定亲缘关系最近菌种的完整法尼基转移酶基因的序列，根据该法尼基转移酶基因的序列设计第二简并引物，利用第二简并引物和基因组DNA，扩增得到细菌一的完整法尼基转移酶基因基因。采用这种方法能得到大量的完整法尼基转移酶基因序列，相比于基因库中的法尼基转移酶基因，本发明能得到基因库中未公开的法尼基转移酶基因，显著增加了法尼基转移酶基因的种类，为法尼基转移酶研究和他汀类药物生产提供丰富的候选基因资源。

附图说明