[发明专利]一种天冬氨酸氨裂合酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种天冬氨酸氨裂合酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，与初始型天冬氨酸氨裂合酶AspB相比，显著提高了催化丙烯酸生成β‑丙氨酸的酶活力。采用表达该天冬氨酸氨裂合酶突变体的全细胞催化120g/L丙烯酸底物反应生成β‑丙氨酸时，转化率超过95％，具有工业化应用前景。

技术领域

本发明属于酶催化技术领域，具体地说，涉及一种天冬氨酸氨裂合酶突变体、及其用于酶法催化丙烯酸生产β-丙氨酸的用途。

背景技术

β-丙氨酸有香味、甜味，易溶于水，微溶于乙醇，是自然界中存在的一种天然β型氨基酸。β-丙氨酸是一种天然的非蛋白氨基酸，在生物体内不直接参与蛋白质的合成，但参与多种功能性物质如肌肽、维生素B5的合成，是一种功能性的氨基酸，被广泛应用于医药、食品、化工等行业。β-丙氨酸主要用于合成泛酸、泛酸钙、肌肽、帕米磷酸钠、八柳氮等，也可作为一种膳食补充剂为肌肉提供能量。

β-丙氨酸制备方法有化学法、酶法及发酵法三种方法。其中，化学法和酶法是现在主要的生产方法。化学法包括丙烯腈法、β-氨基丙腈法、琥珀酰亚胺降解法等，但这些方法为高温、高压反应，工艺条件苛刻，且反应过程副产物较多，提取过程复杂，成本高，环境不友好，这些不可避免的缺点导致化学法合成β-丙氨酸在市场上的竞争力越来越弱。酶法催化合成β-丙氨酸主要指的是L-天冬氨酸在L-天冬氨酸α脱羧酶(ADC)催化下脱羧生成β-丙氨酸，该方法催化效率高、条件温和、提取工艺简单环保，长久以来成为β-丙氨酸酶法催化合成研究的热点。但该方法需要使用相对昂贵的底物天冬氨酸，因此导致工艺成本较高，工业化应用方面受到很大的限制。发酵法采用廉洁易得的葡萄糖作为起始原料，一直是人们研究的热点，鲁东大学于2019在大肠杆菌工程菌中实现了以葡萄糖为原料发酵产β-丙氨酸，产量高达50g/L，糖酸转化率达40％(CN201910474753.9)，这是已有报道的发酵法产β-丙氨酸的最高产量，尽管如此，由于该方法存在发酵副产物较多、提取工艺复杂、生成成本高等问题，导致该方法还仅限于实验室研究阶段。

2018年中科院微生物研究所吴边实验室采用计算机模拟技术，通过理性改造，成功对Bacillus sp.YM55-1来源的天冬氨酸氨裂合酶(AspB)的底物谱进行了改变，以烯酸为底物实现了多种β型氨基酸的高效合成，其中以巴豆酸为底物合成β-氨基丁酸，底物浓度可以达到300g/L，转化率达到99％，产物β-氨基丁酸的ee值超过99％(Ruifeng Li.et al,Computational redesign of enzymes for regio-and enantioselectivehydroamination.Nat.Chem.Biol.,2018)。

我们对于使用Bacillus sp.YM55-1来源的天冬氨酸氨裂合酶AspB催化合成β-丙氨酸进行了研究，发现该酶能够以丙烯酸或丙烯腈为底物经催化反应得到β-丙氨酸，但转化率较低，判断为AspB酶活力低造成的，因此有必要对该技术进行优化。

发明内容

为了探索使用廉价的丙烯酸或丙烯腈为底物、经酶催化制备β-丙氨酸的工业化可行性，本发明利用基因工程技术来对Bacillus sp.YM55-1来源的天冬氨酸氨裂合酶(AspB)进行改造和筛选，构建针对丙烯酸或丙烯腈高酶活性的天冬氨酸氨裂合酶突变体，从而有利于实现全新酶催化法生产β-丙氨酸的工业化。

为此，本发明通过随机突变、半理性设计等技术对Bacillus sp.YM55-1来源的初始型天冬氨酸氨裂合酶(SEQ ID NO:1)进行改造，获得能够以丙烯酸或丙烯腈作为特异性底物的高酶活的天冬氨酸氨裂合酶突变体，以便高效地将丙烯酸或丙烯腈催化生成β-丙氨酸。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种酶活力高的天冬氨酸氨裂合酶突变体。

本发明的第二个目的在于提供编码上述天冬氨酸氨裂合酶突变体的基因。

本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。