[发明专利]一种虾夷扇贝肌原纤维的分离和鉴定方法

权利要求书

1.一种虾夷扇贝肌原纤维的分离和鉴定方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下：

步骤一，取虾夷扇贝新鲜带壳闭壳肌组织，用扇贝肌肉专用洗涤液洗去包括膜蛋白在内的杂质，加入新鲜配制的扇贝肌肉松弛缓冲液，旋转搅拌3天；

步骤二，切取闭壳肌组织，加入扇贝肌肉松弛缓冲液，使用组织匀浆器在高速模式下运行，直至扇贝肌肉组织块完全消失；

步骤三，在4℃条件下15000 × g离心2 min去除包括组织块残留在内的大颗粒，上清液加入扇贝肌肉松弛缓冲液，4℃条件下17000 × g 离心20 min获得粗肌丝的沉淀物，用扇贝肌肉松弛缓冲液迅速吹打，立即进行涡旋混匀，15000 × g 离心2 min获得上清液；

步骤四，在步骤三最后一次离心获得的上清液中加入扇贝肌肉松弛缓冲液，17000 ×g 离心30 min获得粗肌丝的沉淀物，再用扇贝肌肉松弛缓冲液吹打混匀，15000 × g离心5 min，所得到的上清液即为纯化的粗肌丝悬浮液，可直接用于SDS-PAGE检测及电镜分析；

步骤五，吸取6 μL粗肌丝悬液放到电镜专用超薄碳膜的中央，使用肌肉松弛清洗液冲洗金属网，在无菌枪头中依次吸入质量比1%醋酸双氧铀染液、空气和肌肉激活缓冲液，冲洗金属网，自然晾干保存，在电镜下观察拍照；

所述的扇贝肌肉松弛缓冲液配制方法：制备包含以下终浓度成分的混合溶液NaCl100mM、MgCl₂3mM、EGTA 1mM、Pipes 5mM、NaH₂PO₄ 5mM、 NaN₃ 1mM和 MgATP 5 mM，调节pH值为7.0，0.2 μm微孔滤膜过滤，高压灭菌；

在步骤一中，所述的扇贝肌肉专用洗涤液配制方法：将0.1g皂素加入100ml扇贝肌肉松弛缓冲液中，混匀直至完全溶解；

在步骤五中，所述的肌肉松弛清洗液配制方法：制备包含以下终浓度成分的混合溶液:NaAC 100mM、MgCl₂ 3 mM、EGTA 0.2mM、imidazole 2mM、NaN₃ 1mM和MgATP 1 mM, 调节pH至7.0，0.2 μm微孔滤膜过滤，高压灭菌；

所述的肌肉激活缓冲液配制方法：将2mg 无水CaCl₂加入到肌肉松弛清洗液中，混匀直至完全溶解。