[发明专利]烟草多酚氧化酶基因NtPPO2a和/或NtPPO2b在抗旱烟草品种选育中的应用

说明书

本发明公开了烟草多酚氧化酶基因NtPPO2a和/或NtPPO2b在抗旱烟草品种选育中的应用，NtPPO2a核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，NtPPO2b核苷酸序列如SEQ ID：No.2所示。NtPPO2a编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；NtPPO2b编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.4所示。烟草多酚氧化酶基因NtPPO2a和/或NtPPO2b的定点突变方法包括载体构建与pORE‑CRISPR/Cas9表达载体的农杆菌转化及烟草的遗传转化等步骤。利用实时荧光定量PCR对烟草品种进行检测分析，当烟草多酚氧化酶基因NtPPO2a和/或NtPPO2b发生突变时，该品种抗旱性能降低。本发明为抗旱烟草品种选育提供了基础材料与检测方法。

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及烟草多酚氧化酶基因NtPPO2a和/或NtPPO2b在抗旱烟草品种选育中的应用。

背景技术

植物从水生进化成陆生后，除拟南芥以外的陆生植物都具有多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）。PPO具有多种生理功能。首先，PPO在氧的作用下将无色单酚或者双酚类物质直接或者间接氧化成有色的醌类物质；其次，PPO在橙酮和B族维生素的次生代谢方面也具有重要的生理功能；最后，PPO在植物受到逆境胁迫也发挥重要的生理功能。例如，当植物受到外界生物性因素如昆虫、病原菌的侵害时，PPO基因会启动防御反应。当植物受到非生物因素如环境温度极度变化时，可能由于活性氧（reactive oxygenspecies, ROS）浓度变化介导PPO基因启动了应激反应。有研究表明橄榄树抑制PPO活性导致酚醛氧化程度降低，并且显示出更佳的抗氧化能力。细胞程序死亡研究中，在胡桃中沉默PPO基因能够导致酪氨酸增加，延缓了由于酪氨酸的降解导致细胞死亡。番茄中通过转基因的方法降低PPO的活性提高了抗干旱的能力。相对于抗病方面的研究，PPO基因参与非生物性因素胁迫方面的研究及其机理并不十分清晰。

植物中PPO基因不仅功能复杂，而且大多以基因家族的形式存在，并且家族成员众多。例如，马铃薯中经过鉴定的PPO有9个，番茄7个，玉米6个，大豆11个，而在丹参中甚至多达19个。不仅如此，PPO 基因往往以串联的形式存在，如马铃薯的PPO 主要串联在8 号染色体的一段区域；番茄的7 个基因位于8号染色体165 kb 的一段区域等。PPO在同种属植物中的序列具有高度相似性。PPO基因在茄子与马铃薯的之间DNA 序列相似性为82 %，与番茄基因序列相似性为84.9 %。