[发明专利]重组草铵膦脱氢酶、基因工程菌及其在制备L-草铵膦中的应用

说明书

本发明公开了重组草铵膦脱氢酶、基因工程菌及其在制备L‑草铵膦中的应用，该重组草铵膦脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过交错延伸pcr基因重排技术，构建获得重组草铵膦脱氢酶的基因文库，并从中筛选获得酶活、催化性能和立体选择性均高的重组草铵膦脱氢酶；该重组草铵膦脱氢酶的活性较之前突变体PPTDHE3‑A164G和突变体PPTDHE0‑V375S分别提高了31％和35％，最终完全催化108g/L的2‑羰基‑4‑(羟基甲基氧膦基)‑丁酸生产L‑草铵膦仅仅需要20分钟(转氨酶通常需要40小时)，且ee值大于99.5％。

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及重组草铵膦脱氢酶、基因工程菌及其在制备L-草铵膦中的应用。

背景技术

草铵膦(glufosinate-ammonium)的化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产，又称草铵膦铵盐、Basta、Buster等，属膦酸类除草剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂是谷氨酰胺合成酶抑制剂。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。

手性纯L-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下三类：

1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要的优点转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料作为前体，成本加高，不利于工业化生产。例如生物法制备L-草铵膦最简单的方法就是利用蛋白酶直接水解双丙氨膦。双丙氨膦是一种天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，双丙氨膦脱去2分子L-丙氨酸，生成L-草铵膦。

2)以外消旋草铵膦的前提为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但其理论收率只能达到50％，会造成原料的浪费。例如一种采用α-胰凝乳蛋白酶拆分双丙氨膦乙酯制备L-草铵膦的方法，该法首先经过3步反应将外消旋的草铵膦合成双丙氨膦二乙酯，接着用碱性mesinterico肽酶将其C端脂基水解。再经α-胰凝乳蛋白酶催化水解肽键。在该步反应中，α-胰凝乳蛋白酶能选择性水解L-双丙氨膦乙酯，生成L-草铵膦乙脂。最后利用磷酸二脂酶水解P端酯基得到L-草铵膦。