[发明专利]一种水环境中人类粪便指示物的定量检测方法

说明书

本发明涉及一种水环境中人类粪便指示物的定量检测方法。包括：选用人类粪便DNA为模板，采用PCR扩增目的基因CPQ_056片段；切胶回收纯化扩增后的目的基因，将基因连接在载体pTOPO‑Blunt上，然后转化感受态大肠杆菌细胞，挑选阳性克隆子；用琼脂糖凝胶电泳检测扩大培养菌液的质量，选克隆成功的菌液提取质粒，检测质粒浓度，换算出质粒所携带目的基因的拷贝数，并按10倍为稀释梯度稀释，作为标准品；将标准品进行定量PCR扩增，做出标准曲线。再将水样DNA进行定量PCR扩增，从而最终得出水环境中人类粪便指示基因的拷贝数。本发明不依赖于微生物培养，操作简单，检测速度高，灵敏度高，数量上也更为直观。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水环境中人类粪便指示物的定量检测方法。

背景技术

一直以来，人类粪便排放导致的环境污染和公众健康问题都备受关注。人类粪便中含有大量的致病菌、耐药基因等污染物，通过未经处理或部分处理的污水排入环境，致使许多环境水域受到污染。目前，水质监测主要利用粪便细菌作为水环境粪便污染指标，但是这些指示物无法区分人类和动物粪便，许多之前开发的人类粪便污染指标缺乏足够的敏感性，无法在环境水域可靠地检测到，或者与病毒病原体没有很好的相关性。

近年来，研究者通过宏基因组数据挖掘发现了一种新的噬菌体crAssphage，并报道了其在人类粪便中大量存在并与人类粪便污染密切相关。因此利用生物技术，找寻一种高度的人类特异性，在污水中含量丰富的，可高效测定指示物在不同水环境中的拷贝数，进而检测水环境中人类粪便排放情况具有重要意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种具有高度的人类特异性，可高效测定目的基因在不同水环境中的拷贝数的水环境中人类粪便指示物的定量检测方法。

本发明采用的技术方案是：一种水环境中人类粪便指示物的定量检测方法，包括如下步骤：

(一)生成目的基因标准曲线：以CPQ_056基因为目的基因，从人类粪便中提取CPQ_056基因片段，以目的基因CPQ_056的拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，生成CPQ_056目的基因标准曲线；具体为：

1)提取人类粪便的DNA；以人类粪便DNA为模板，以正向引物F-primer和反向引物R-primer为特异性引物以及探针进行定性PCR扩增，扩增目的基因CPQ_056的片段；

所述正向引物F-primer、反向引物R-primer和探针的序列为：

F-primer：CAGAAGTACAAACTCCTAAAAAACGTAGAG

R-primer：GATGACCAATAAACAAGCCATTAGC

探针：[FAM]AATAACGATTTACGTGATGTAAC[MGB]

所述定性PCR扩增，定性PCR扩增体系为，反应体系体积为25μL，包括：

定性PCR扩增反应程序：95℃5min，95℃30s，59℃ 30s 40个循环，72℃30s，72℃4min。

2)切胶回收纯化扩增后的目的基因CPQ_056的片段，将目的基因CPQ_056连接在pTOPO-Blunt载体上，然后转入感受态大肠杆菌中，转化后的大肠杆菌经培养后，涂LB平板，然后挑选阳性克隆子，用LB液体培养基扩大培养；

3)用琼脂糖凝胶电泳检测扩大培养菌液的质量，挑选克隆成功的菌液提取质粒，检测质粒浓度，按公式(I)换算出质粒所携带目的基因CPQ_056的拷贝数，并按10倍为稀释梯度稀释，制备含有不同拷贝数的菌液；