[发明专利]拟南芥突变体的原生质体在分析信号转导途径中的应用

说明书

本发明公开了拟南芥突变体的原生质体在分析信号转导途径中的应用。分析信号转导途径的步骤为：(1)构建蛋白融合报告基因表达载体、效应载体和内部对照载体；蛋白融合报告基因表达载体表达含有蛋白标签甲的融合蛋白；融合蛋白由目的蛋白甲和萤火虫荧光素酶组成；效应载体表达含有蛋白标签乙的目的蛋白乙；内部对照载体表达海肾荧光素酶；(2)将蛋白融合报告基因表达载体、效应载体和内部对照载体在拟南芥突变体的原生质体中瞬时表达，然后分析信号转导途径。本发明为拟南芥原生质体中植物激素信号通路的重建和研究提供了一种新的策略，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及拟南芥突变体的原生质体在分析信号转导途径中的应用。

背景技术

植物在生长过程中不断地受到各种各样的环境压力，这些压力会对植物的生长和产量带来负面影响。为了应对不同的环境胁迫，植物进化产生了特定的信号网络来协调其生长与发展和环境适应。了解这些信号转导途径的分子机制对于培育对环境胁迫具有耐受性的植物非常重要。由于其复杂性，植物信号转导途径的研究非常费时费力。而且，大部分植物没有基因组序列、转基因方法或突变体文库等，信号途径的研究更具挑战性。目前，只有在一些模式植物(如拟南芥、水稻、烟草和番茄)中，JA茉莉酸(JA)信号通路研究的相对较为透彻。

植物激素茉莉酸(JA)由脂肪酸衍生，参与调节很多植物发育和环境胁迫反应。JA通过茉莉单酰基-L-氨基酸合成酶的催化与异亮氨酸结合，形成主要的具有生物活性的JA衍生物，即茉莉单酰基-L-异亮氨酸(JA-Ile)。在过去的几十年中，遗传、生物化学和蛋白质结构分析等方法的结合已经确定了模式植物拟南芥中JA信号转导的核心成分。JA-Ile促使F-box蛋白CORONATINE INSENSITIVE1(COI1)和JASMONATE-ZIM DOMAIN(JAZ)转录阻抑蛋白相互作用，两者协同起JA受体的作用。COI1作为E3泛素连接酶，将JAZ蛋白泛素化并随后通过26S蛋白酶体降解。在没有JA-Ile的情况下，JAZ通过与Novel Interactor of JAZ(NINJA)蛋白相互作用来募集转录共阻遏物，从而抑制MYC2转录因子。拟南芥JAZ蛋白家族有12个成员。所有JAZ蛋白都包含两个保守的序列基序：介导NINJA相互作用的ZIM-motif(也称为TIFY-motif)和介导COI1相互作用的Jas-motif。COI1-JAZ受体复合物感应JA后，导致转录抑制因子JAZ的降解，从未释放MYC2转录因子活性，MYC2进而激活JA调控基因的表达。

从植物组织新鲜分离的原生质体保持原有细胞的特性和分化状态。从植物叶片中分离的叶肉原生质体表现出对外源激素、异源化学物质和环境刺激的生物学感知和生理反应，类似于完整组织和植物中的内部细胞。原生质体瞬时基因表达系统为研究亚细胞蛋白定位、转录调控、基因组编辑和植物合成生物学提供了宝贵的方法，由于其灵活性和便利性，已成为一种分子生物学研究领域里引人入胜的“瑞士军刀”，用于解析各种植物信号转导机制，进而研究信号通路。

发明内容

本发明的目的是研究信号转导途径，例如信号转导途径的组分、相互作用、调控物质等。

本发明首先保护一种分析信号转导途径的方法，可为采用拟南芥突变体的原生质体分析信号转导途径。

上述方法中，所述“采用拟南芥突变体的原生质体分析信号转导途径”的步骤可如下：

(1)构建蛋白融合报告基因表达载体、效应载体和内部对照载体；

蛋白融合报告基因表达载体中含有表达盒甲，表达盒甲从5’至3’依次包括启动子甲、编码蛋白标签甲的核苷酸序列、目的蛋白甲的编码基因和萤火虫荧光素酶的编码基因；蛋白融合报告基因表达载体表达含有蛋白标签甲的融合蛋白；融合蛋白由目的蛋白甲和萤火虫荧光素酶组成；

效应载体中含有表达盒乙，表达盒乙从5’至3’依次包括启动子乙、编码蛋白标签乙的核苷酸序列和目的蛋白乙的编码基因；效应载体表达含有蛋白标签乙的目的蛋白乙；