[发明专利]一种酶活测定用的电化学传感器及其制备方法、凝乳酶活性的电化学测定方法

说明书

本申请提供了一种酶活测定用的电化学传感器及其制备方法、凝乳酶活性的电化学测定方法，属于电化学传感器。本申请提供的酶活测定用的电化学传感器，制作简单，方便检测；且对电流信号变化敏感。利用该电化学传感器进行酶活的测定，不使用复杂的底物，操作过程简单，测量的精度高，特异性比较强，能较好的避免不必要的干扰；而且稳定性好，能重复使用，能降低检测的成本；同时测试反应的时间也较短，方便快速检测，具有较高的使用价值。

技术领域

本申请涉及电化学传感器领域，具体而言，涉及一种酶活测定用的电化学传感器及其制备方法、凝乳酶活性的电化学测定方法。

背景技术

奶酪是世界上主要的乳制品之一。目前，大多数的奶酪都是用凝乳酶作为凝结剂生产的。凝乳蛋白酶和胃蛋白酶对酪蛋白有不同的特异性水解作用，并显著影响奶酪的风味及品质。与其它凝乳酶相比，凝乳酶凝乳活性较高，有利于干酪的制作。同时，残余的凝乳蛋白酶被认为是奶酪软化的原因之一。因此，凝乳酶的测定是干酪生产中一个重要的科学、技术、工业和经济指标。

凝乳酶是一种特殊的乳凝血天冬氨酸蛋白酶，它能特异性水解酪蛋白中的105苯丙氨酸-106甲硫氨酸（Phe105-Met106）的肽键，并从蛋白的C端释放出长为64个氨基酸的亲水性残肽(糖巨肽)，从而导致酪蛋白胶束的凝固和凝胶的形成，最终分离成奶酪和乳清。

测定蛋白酶活性的经典方法是在牛奶沉淀开始絮凝时，通过肉眼观察测定加入凝乳蛋白酶后牛奶的凝结时间来确定凝乳酶的活性。国际乳制品联合会则采用色谱法进行凝乳酶活性的测定。另外，酶联免疫吸附试验(ELISA) 、高效液相色谱(HPLC) 和质谱等方法也已被开发用于凝乳酶的定量。虽然这些方法可以有效地测定凝乳酶，但这些方法仍存在一定的缺点，如观察的主观性、耗时、仪器昂贵、效率低、测量步骤长、预处理繁琐等，阻碍了其实际应用。

申请内容

本申请的第一方面公开了一种酶活测定用的电化学传感器，电化学传感器包括裸电极、沉积在裸电极表面的金属镀层，以及结合于金属镀层的底物肽段。

本申请设计的底物肽段的等电点较高，在中性环境时，肽段带正点，与溶液中的带正电荷的离子排斥，导致电流较低；当底物肽被凝乳酶水解后，正电荷片段脱离，电极上剩下中性肽片段，这时带正电荷的离子容易接近电极，从而使电流升高；因此可以通过此电极测定凝乳酶活性。

在前述的第一方面的一些实施例中，裸电极为玻碳电极、金电极、银电极、铂电极。

在实施例中，玻碳电极是玻璃碳电极的简称。玻璃碳电极的优点是导电性好，化学稳定性高，热胀系数小，质地坚硬，气密性好，电势适用范围宽(约从-1～1V，相对于饱和甘汞电极)。

在前述的第一方面的一些实施例中，金属镀层为金镀层。

在实施例中，金属材料中，银和铜的导电性最好，金次之；然而银和铜都比金活跃，在自然环境或者氧化还原条件下，容易发生反应而影响其导电性；因此本申请中选用较为导电性和稳定性都较好金作为金属镀层。

在前述的第一方面的一些实施例中，底物肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在实施例中，SEQ ID NO.1所示的底物肽的氨基酸序列为：CGGGHPHPHLSFMAIPPKK；多肽的N端的半胱氨酸残基与Au/GCE结合，GGG有利于多肽与Au/GCE的高效结合。凝乳酶能对F和M残基之间的肽键进行剪切。