[发明专利]一种酶法制备亚精胺的方法

说明书

本发明公开了一种酶法制备亚精胺的方法，该方法以BL21DE3为出发菌株，在出发菌株基础上过分别过表达了来源于大肠杆菌K12中编码S‑腺苷甲硫氨酸脱羧酶的speD基因和编码亚精胺合成酶的speE基因，通过上述操作得到两株工程菌，通过细胞破碎得到的粗酶液进行反应后得到亚精胺的产量为1g/L。与现有技术相比，本发明方法生物合成法有着绿色，高产，条件温和等优点，尤其是副产物少，对环境友好度高。

技术领域

本发明涉及亚精胺的生产领域，具体涉及一种酶法制备亚精胺的方法。

背景技术

亚精胺是一种广泛存在生物体内的多胺类物质，在抗衰老、保护心血管、改善代谢性疾病等领域有着巨大的潜力。最早的亚精胺是从精液中分离而被发现的，但实际上它是生物体内广泛存在的一种物质，全麦食物、海带、马齿苋、蘑菇、成熟奶酪、豆类和全谷类均富含这种成分。

目前市场上制备亚精胺的主要方法是化学制备法和提取法，如发明专利CN102659605公布了一种亚精胺的合成方法，该专利的制备方法是先制备Cbz单保护的 1,4-丁二胺，然后将其与丙烯腈进行加成反应，最后将氰基还原并脱除Cbz保护，最后得到亚精胺产品。如发明专利CN 109096122以氨基丙醇和丁内酯为原料反应后，经过还原、氨基保护等步骤，制备得到了亚精胺。化学合成法的耗能高，副反应多，污染大，而提取法制作繁琐，产物纯度低，导致亚精胺价格昂贵。

目前生物合成法有着绿色，高产，条件温和等优点，有望克服化学合成法和提取法的缺点。如发明专利CN 110257313通过在芽孢杆菌中构建表达相关基因并通过发酵的方式最终得到亚精胺产量为56.59 mg/L。然而发酵法反应过程具有不确定性、细胞膜对底物或酶的通透性、副产物导致的产物的降解及副产物的累积等，都阻碍了其在工业上的推广。与发酵法相比，酶法的优点在于反应的产物更加专一，过程易于控制， 反应体系中不含有微生物、有毒的原料试剂等杂质，非常有利于后续的分离纯化。目前酶法生产亚精胺的报道较少，原因在于酶的制备复杂，不能很好的控制反应进程，因此，需要进一步的探索。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种酶法制备亚精胺的方法，该方法以

大肠杆菌BL21DE3为出发菌株，分别过表达了大肠杆菌speD基因和speE基因，利用粗酶液反应生产亚精胺的产量为1g/L。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种酶法制备亚精胺的方法，包括以下步骤：

步骤1，构建质粒pcwj-speD和质粒petduet-speE

（1）构建质粒pcwj-speD：

设置上游引物带有EcoR I酶切位点，

序列1为CCGGAATTCTTGAAAAAACTGAAACTGCATGGC，

设置下游引物带有BamH I酶切位点，

序列2为CGCGGATCCTTAAACAGCTGGCATATTGCGC，

大肠杆菌KA30的基因组DNA（来自全式金公司的商业化大肠杆菌K系列菌株）作为模板扩增得到片段speD,将保在DH5α（商业化）中的pcwj质粒进行提取，选取酶切位点EcoR I和BamH I，将片段和质粒都进行双酶切操作，酶切完成后，分别进行胶回收，完成后检测质粒浓度；使用T4 DNA Ligase(Takara)将胶回收之后的质粒和片段进行连接后，转化感受态,涂板于带有氯酶抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后使用质粒通用引物进行菌落PCR验证，同时划线于相同抗性的平板上培养8-12h，经核酸凝胶电泳验证后挑选正确的阳性结果进行提质粒并经公司测序，确认插入序列无误即为成功构建质粒pcwj-speD；