[发明专利]一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法及其应用

说明书

本发明涉及微生物遗传转化技术领域，具体涉及一种采用镁硅酸盐纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法及其在丝状真菌基因工程和功能研究中的应用，所述方法包括以下步骤：1)提取质粒；2)制备镁硅酸盐纳米粘土悬浮液；3)制备基因‑镁硅酸盐纳米粘土载体复合物；4)制备受体菌悬浮液；5)镁硅酸盐纳米粘土介导转化；所述应用为上述纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法在丝状真菌遗传转化中的应用。本转化方法最大优点是无明显的寄主限制，几乎适合于任何受体材料，操作简单，适用于高通量筛选所需的简便操作流程。

技术领域

本发明涉及微生物遗传转化技术领域，具体涉及一种采用镁硅酸盐纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法及其在丝状真菌基因工程和功能研究中的应用。

背景技术

丝状真菌是许多工业和农业生产菌株，DNA遗传转化技术是对丝状真菌进行菌种改良、提高生产效率、进行基因克隆和研究基因功能的重要研究手段。目前对于丝状真菌来讲，常用的遗传转化方法有PEG介导的原生质体转化、电转化、根癌农杆菌介导转化和限制酶介导整合转化、醋酸锂的转化等。

PEG介导的原生质体转化和限制酶介导整合转化通常是需要制备丝状真菌原生质体的，而丝状真菌的原生质体制备是转化中的一大难点。虽然，原生质体制备方法大同小异，但要制备数量多、质量高的原生质体，并能成功转化需要注意脱壁酶的选择、菌丝龄的大小、细胞预处理、高渗液、再生率、融合频率等因素的影响。不同的丝状真菌转化率差异非常大，同时也存在转化率低、稳定性差、细胞易聚合产生二倍体甚至多倍体等问题。

经典的电转化法通常也还是需要制备原生质体的，但其转化效率并不高，因此限制了其应用。目前许多学者通过改良电转化的方法已经提高了转化的效率，如2012年Schuster通过改良，实现了利用木霉进行电转化的方法，为电转化的应用提供新的契机；但其对设备要求高，需要专门的电转化设备支持。

根癌农杆菌介导的丝状真菌转化是目前很多研究人员采用的一种转化方法，与其他遗传转化方法相比，具有不用制备原生质体，受体细胞来源简单，孢子、菌丝均可，同时该方法相较其他转化方法转化率高，一般是单拷贝，转化子稳定性好。现在已经有大量根癌农杆菌介导转化的成功实例，已成为工农业重要丝状真菌分子遗传学研究的重要手段，但其转化过程相对还是比较繁琐，影响因素多，对于某些菌株来说转化效率也不甚理想。

因此，为了实现丝状真菌遗传改良高通量筛选需要发明一种操作简单、转化效率高转化方法。

发明内容

针对现有技术缺少一种操作简单、转化效率高的丝状真菌遗传转化方法的问题，本发明提供一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法及其应用，本方法利用镁硅酸盐纳米粘土材料可以和丝状真菌的细胞膜结合，同时能在细胞膜上形成孔洞的特点，使介导遗传物质进入丝状真菌细胞内，然后整合到受体细胞或组织染色体上并进行表达，从实现外源基因的转化。

第一方面，本发明提供一种纳米粘土介导的丝状真菌遗传转化方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取质粒；

2)制备镁硅酸盐纳米粘土悬浮液；

3)制备基因-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物；

4)制备受体菌悬浮液；

5)镁硅酸盐纳米粘土介导转化。

进一步的，所述步骤1)包括：提取丝状真菌整合质粒，将浓度浓缩为100～1000ng/uL。

进一步的，所述步骤2)包括：称取镁硅酸盐纳米粘土载体，利用无菌超纯水将其制备成质量分数0.1％的悬浮液，将配置好的悬浮液放入无菌密封试管中，然后置于超声波仪中超声5min备用。

进一步的，所述镁硅酸盐纳米粘土载体的制备方法包括以下步骤：