[发明专利]阪崎克罗诺杆菌核酸快速恒温检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物组及试剂盒。所述方法为：从待测样品中提取基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，以能扩增阪崎克罗诺杆菌特异性序列的引物组为引物，在酶反应体系下进行恒温扩增反应；通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在阪崎克罗诺杆菌。本发明检测方法具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低，具广泛应用前景。

本申请是2016年8月30日提交的、申请号为201610767354.8、发明名称为：“快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物及试剂盒”的中国发明专利申请的分案申请；该母案申请要求申请日为2015年9月2日、申请号为201510556917.4、发明名称为“快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物及试剂盒”的中国发明专利申请的优先权。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物及试剂盒。

背景技术

阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种革兰氏阴性、周生鞭毛、能运动、无芽孢的兼性厌氧细菌，1980年前称为非典型的产黄色素的阴沟肠杆菌，1980年后曾更名为阪崎肠杆菌，2008年重新分类命名，被划归于肠杆菌科克罗诺杆菌属。阪崎克罗诺杆菌广泛存在于自然界，是通过配方粉危害婴幼儿健康的重要条件性致病菌，能引起婴儿严重的临床症状，如脑脓疡，脑膜炎，坏死性小肠结肠炎和全身性败血症等，致死率高达40％-80％。新生婴儿或早产儿都存在通过食用污染有阪崎克罗诺杆菌的婴儿配方粉而感染阪崎克罗诺杆菌菌株的风险。与其他食源性致病微生物相比，虽然阪崎克罗诺杆菌感染率不高，但对于特殊人群却有着较高的致死率，并且该菌的宿主及传播模型尚并不是十分清楚。因此对于该菌的预防和检测尤为重要。

目前，国内外针对阪崎克罗诺杆菌的检测方法仍以常规培养方法作为标准，但检测周期较长(达5-7天)，操作相对复杂，检测效率较低，难以满足现代社会对于食源性致病菌检测过程高通量、高灵敏度、高特异性、快速、便捷的要求。随后研究人员陆续开发出了PCR和荧光PCR技术的检测手段，也被纳入到我国的“奶粉中克罗诺杆菌的检测方法”的行业标准，但是这两种方法需要专门的检测仪器，因此，并不适合广泛应用于基层检测部门尤其是企业生产线内部进行的实时实地检测。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游内引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2组成，BIP由B1C和B2组成)，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀(见文献Notomi T,OkayamaH,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermalamplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000 Jun 15；28(12):E63)。该技术具有不需要PCR仪或荧光定量PCR仪、恒温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作便捷、成本低等优点。