[发明专利]一种甲基转移酶AprI及其编码基因和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种甲基转移酶AprI及其编码基因和应用。本发明从黑暗链霉菌中克隆得到了甲基转移酶基因aprI，全长789bp，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过基因敲除技术在黑暗链霉菌中敲除aprI基因可以获得7’C‑N‑去甲基安普霉素。通过同源重组技术在黑暗链霉菌中过表达aprI基因，可以降低7’C‑N‑去甲基安普霉素含量提高安普霉素含量，优化安普霉素产品质量。本发明的AprI及aprI可用于获取安普霉素的特定组份或用于合成新型氨基糖苷类化合物，在研究、药物生产方面具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于抗生素制药领域，涉及一种甲基转移酶AprI及其编码基因和应用，具体地说，本发明提供了一种甲基转移酶，并利用分子生物学技术，通过对黑暗链霉菌中安普霉素生物合成基因aprI的阻断和过表达，获得去甲基安普霉素生产菌株和优化安普霉素组份产生菌株。

背景技术

氨基糖苷类抗生素是世界上最常用的抗生素之一，因为它们具有高效性，低过敏性和低成本的优点。安普霉素已用于兽医但未用于治疗人类感染性疾病，是一种结构独特的氨基糖苷类抗生素，可有效对抗广泛的革兰阳性菌和革兰阴性菌。根据体内体外毒性实验表明，与其他氨基糖苷类抗生素相比，安普霉素的毒性要小很多，有着显著的安全范围且副作用小。安普霉素生物合成的研究可为开发高效低毒的药物和获取新型氨基糖苷类药物提供理论依据。

黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)是工业上重要的微生物，其主要产生氨基糖苷类安普霉素，氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素B。

安普霉素是一种4-取代的2-DOS类氨基糖苷类抗生素，其由三部分组成，分别为：4-氨基-4-脱氧-α-吡喃型葡萄糖、辛二糖胺和2-DOS。Piepersberg W报道了黑暗链霉素中安普霉素生物合成基因簇(GenBank ID:AJ629123)，为安普霉素生物合成途径研究提供了信息。目前主要通过同源性分析推测基因的功能，安普霉素生物合成基因簇中与2-DOS合成相关的基因aprC、aprS和aprE以及与巴龙霉胺合成相关的基因aprM、aprN和aprQ在同源比对中与其他2-DOS类抗生素有着较高的相似度，其余基因并未发现相似度较高的同源基因，属于安普霉素生物合成基因簇中特有部分。李相丰利用阻断突变株法，通过诱变筛选获得生物合成阻断变株，将安普霉素生物合成前体物质2-DOS、巴龙霉胺、安普霉胺等进行了生物转化实验，推断出可能的安普霉素生物合成途径：2-DOS→巴龙霉胺(paromamine)→安普霉胺(aprosamine)→安普霉素(apramycin)。许铭翾等利用喂养实验法和同位素示踪法，向发酵培养基中添加不同的氨基酸以探究其对安普霉素产量的影响，发现添加甘氨酸能够提高菌体胞内的S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)水平，证实了甘氨酸是安普霉素生物合成中唯一的取代甲基-辛二糖环上C-7′-N-甲基的供体。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种甲基转移酶AprI及其编码基因和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种编码甲基转移酶AprI，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种编码甲基转移酶的基因aprI，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，本发明提供了所述编码甲基转移酶的基因aprI在制备氨基糖苷类化合物的生物合成中的应用。

所述的氨基糖苷类化合物可以为安普霉素、安普霉胺、β-甲基安普霉胺。

对上述甲基转移酶的编码基因aprI进行框架内全删除，构建aprI阻断菌株黑暗链霉菌△aprI。aprI阻断菌株经发酵及产物鉴定为7’C-N-去甲基安普霉素。

本发明所述的应用包括如下步骤：

(1)黑暗链霉菌△aprI的构建